MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用
MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用
蔡燕 彭乙华 黄义山 杨明辉 罗书久 谢文光
作者单位：637000 四川川北医学院附属医院
通讯作者：谢文光
目的 探讨四甲基偶氮唑盐（MTT）法在细菌活性检测和药敏试验中的应用价值。方法 分别采用MTT法和微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌活性以及鲍曼不动杆菌对丁胺卡拉霉素和头孢他啶的敏感性，对两种方法的操作过程和结果进行比较。用统计软件SPSS 16.0对检测结果进行分析。结果 随着细菌浓度增加，微量肉汤稀释法和MTT法检测的活菌或死菌的吸光度值均增加，但用微量肉汤稀释法检测的同一浓度的活菌和死菌的吸光度值之间差别不大，t检验结果显示差异无统计学意义（P>0.05）；而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比，MTT法检测的活菌吸光度值明显增加，t检验结果显示差异均有统计学意义（P＜0.05）；用微量肉汤稀释法和MTT法检测的鲍曼不动杆菌对丁胺卡拉霉素和头孢他啶的敏感
性均与临床药敏结果一致。结论 同微量肉汤稀释法一样，MTT法可以用于检测细菌活性和药敏试验。
标签： MTT法； 药敏试验； 微量肉汤稀释法； 鲍曼不动杆菌 郝叟
The application of MTT assay in detecting of bacteria’工地大门标语s activity and susceptibility test CAI Yan，PENG Yi-hua，HUANG Yi-shan，YANG Ming-hui，LUO Shu-jiu，XIE Weng-guang. Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China 疯子英语
【Abstract】 Objective To rearch the applying value of MTT assay （Tetrazolium salt）in detecting the bacteria’s activity and drug nsitivity.Methods Using the MTT assay and broth microdilution methods to detect the Acinetobacter baumanii’诗经经典s activity and the drug nsitivity of Acinetobacter baumanii to Amikaxinand Ceftazidime.The statistics software spss16.0 was applied to analyze the results.The periods and results of two methods were compared.Results With the concentration of bacteria increasing the optical density of every group detected by the MTT assay or broth microdilution also improved；But there were no difference between the optical density of dead bacteria and living bacteria in the 豆角烀饼
same concentration detected by the broth microdilution method（P>0.05）；When compared with the same concentration of the dead bacteria’s optical density， the optical density of the living bacteria detected by MTT assay incread significantly（P＜0.05）；The results of the drug susceptibility of Amikaxin and Ceftazidime detected by the MTT assay and the broth microdilution were consistent with the clinical conquence.Conclusion The MTT assay has the same function with the broth microdilution in detecting bacteria’s activity and drug nsitivity.
【Key words】 MTT assay； Susceptibility test； Broth microdilution； Acinetobacter baumannii
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药物敏感试验常用于检测细菌对药物的敏感性，以筛选出有效的抗生素指导临床医生治疗感染性疾病。目前常用的方法有纸片扩散法、常量稀释法、微量肉汤稀释法等，其中纸片扩散法虽然应用广泛，但不能定量，而常量稀释法和微量肉汤稀释法不仅操作繁琐，而且由于一些影响浊度的因素干扰，不能准确反映细菌活性，报告时间一般都在48 h以上，故
有必要寻求一种操作简便、可定量、结果更准确、更快速的药敏试验方法以满足临床治疗的需要。由Mosmann［1］首创的MTT比色分析法具有简单、快速、灵敏、稳定等特点，广泛用于细胞生物学研究，国内王栩及向丽等［2，3］曾报道过将MTT法用于活菌计数及细菌药敏试验，认为MTT法可以用于检测细菌活性，并优于常量稀释法，但迄今为止未见MTT法在临床上运用，微量肉汤稀释法仍是进行药敏检测的主要方法，故本实验将MTT法与微量肉汤稀释法进行比较，以探讨MTT法在细菌活性检测及药物敏感试验中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 溶液配制 （1）培养基：水解酪蛋白培养基即MH（Mueller-Hinton，MH）肉汤（购自杭州天和生物制品有限公司），用去离子水稀释，高压灭菌备用。（2）抗生素：丁胺卡拉霉素（0.2 g/2 ml）、头孢他啶（0.5 g/瓶）。均用生理盐水稀释为0.1 g/ml备用。（3）MTT（sigma）：用PBS（磷酸盐缓冲液，0.01 mol/L，pH值7.2）配制为5 mg/ml，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存备用。（4）DMSO（二甲基亚砜）：分析纯，购自天津
市福晨化学试剂厂。
1.1.2 仪器 美国恒温空气浴摇床和恒温振荡水浴培养箱、美国BIO-RAD680型酶标仪。
1.1.3 菌株 随机选取本院微生物室临床分离的鲍曼不动杆菌（采用美国德灵公司生产的NC21鉴定药敏板及配套试剂和Vitek-32进行菌株鉴定和药敏测定，临床药敏结果显示均对丁胺卡拉霉素敏感，将对头孢他啶耐药的菌株定义为1号菌株，对头孢他啶敏感的菌株定义为2号菌株）。
1.2 方法
1.2.1 细菌活性检测 （1）菌液制备：挑取平板上的菌落用MH肉汤于35 ℃恒温摇床上200 r/min过夜培养，约12 h后收集细菌，用生理盐水调整细菌浓度为2.0麦氏单位（约4×10 8 cfu／ml），取4 ml至无菌离心管内，于100 ℃煮沸5 min以制备死菌菌悬液，余约4 ml未煮的细菌悬液作为活菌菌悬液，用MH肉汤倍比稀释死菌和活菌菌悬液至1.00麦氏单位（约2×10 8 cfu／ml）、0.50麦氏单位（约1×10 8 cfu／ml）、0.25麦氏单位（约0.5×10 8 cfu／ml）和0.125麦氏单位（约0.25×10 8 cfu／ml）备用。（2）微量肉汤稀释法：将以上制
备的各菌悬液依次加入96孔微量反应板中，每孔加200 μL，各做8个复孔，另加8孔生理盐水作为空白对照。于450 nm处测定吸光度值。（3）MTT法：将MTT（5 mg/ml）加至已接种死菌和活菌的96孔微量反应板中，每孔加20 μL，于35 ℃继续培养20 min，然后每孔加入DMSO（二甲基亚砜）100 μL，振荡10 min使甲瓒充分溶解，然后将96孔微量反应板于平板离心机中2000 r/min离心5 min，取上清200 μL移至另一96孔微量反应板，再检测570 nm处的吸光度值。
1.2.2 药敏实验 （1）菌液制备：同上将过夜培养的2株细菌调整浓度为0.5麦氏单位，各取10 μL用生理盐水稀释100倍备用。（2）药物稀释：根据临床药敏报告调整丁胺卡拉霉素和头孢他啶的终浓度（见表1），将0.1 g/ml的高浓度药物依次稀释为终浓度的两倍，各取100 μL依次加至96孔微量板中备用。（3）细菌培养：各取10 μL已稀释好的菌悬液接种到96孔微量板的相应孔中，每一个药物浓度每一菌株每个药物浓度组均做3个重复孔，同时设定不加药物和不加细菌的空白孔、不加药物的阳性细菌对照孔和不加细菌的药物对照孔，均做3个重复孔，结果取均值进行相关分析。加样完毕后，将96孔板置恒温水浴振荡培养箱中于（35 ℃）低速振荡（50 r/min）培养。（4）结果检测：培养13 h后（细菌处于对数生长期的一个时间点）于450 nm（微量肉汤稀释法）测定吸光度值（OD值），再按
MTT法检测步骤于570 nm处测定各加样孔的吸光度值，参照向丽等［3］的方法根据吸光度值计算各药物组细菌存活率：细菌存活率=（实验组OD值-不加细菌的药物组OD值）/（不加药物的阳性细菌组OD值-空白孔OD值）×100%。结果判定：细菌存活率50％则对该药为不敏感（R）。
1.3 统计学方法 运用统计软件SPSS 16.0中的t检验对微量肉汤稀释法或MTT法检测的同一浓度的死菌或活菌吸光度值进行比较，用χ 2检验对药敏实验所得两种方法的细菌存活率进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 以细菌浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制微量肉汤稀释法和MTT法检测的不同浓度的死菌和活菌吸光度值检测结果图，并对结果进行统计分析。可见随着细菌浓度增加，微量肉汤稀释法和MTT法检测的活菌或死菌的吸光度值均增加（见图1），但用微量肉汤稀释法检测的同一浓度的活菌和死菌的吸光度值之间差别不大，t检验结果显示无统计学意义（P>0.05）；而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比，MTT法检测的活菌吸光度值明显增加，t检验结果显示差异均有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。
2.2 药敏结果 根据微量肉汤稀释法和MTT法测定的吸光度值计算细菌存活率和药敏结果判定，两种方法的检测结果与临床药敏结果一致（即两株鲍曼不动杆菌对4 μg/ml的丁胺卡拉霉素均敏感，1号菌株对512 μg/ml的头孢他啶耐药，2号菌株对32 μg/ml的头孢他啶敏感）。用χ 二本补录2检验对微量肉汤稀释法和MTT法检测的细菌存活率进行比较，两种方法的检测结果具有显著性差异（P＜0.05）（见表3）。
3 讨论
冷造句随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药问题日益突出［4~6］，严重影响临床疗效和患者安全。细菌感染尤其是耐药菌株感染已成为患者高病死率的重要原因。虽然体外细菌鉴定和药敏实验的开展为临床医生给感染性疾病患者给予个体化的治疗提供了参考依据［7，8］，在一定程度上可减少病程、降低患者的医疗费用、降低死亡率，但是由于送检到获取药敏报告的时间较长（一般要48 h以上）和药敏报告的不准确性，可能会造成治疗延误乃至引起不良后果。故为了得到一份快速、准确的药敏报告，除了严格收集标本、规范化细菌鉴定和药敏试验外［9］，寻求一种便捷、准确的药敏鉴定方法也非常必要。
虽然早在2002年高伟等［10］就提出MTT法是一种快速检测细菌生长繁殖的好方法，王栩
及向丽等［2，3］也通过实验进一步阐述了MTT法在细菌活性检测和药敏试验中应用的可行性，但目前国内外主要在科学研究中用MTT法对细菌活性进行检测（如唐静及Nuryastrti等［11，12］），将MTT法用于临床尤其是能否替代经典的微量肉汤稀释法，仍有必要进行探讨。
本实验结果显示：（1）当用微量肉汤稀释法检测活菌和死菌时，同一浓度的吸光度值差别不大（P>0.05），充分显示该方法的局限性：不能区别死菌和活菌，而死菌极有可能干扰微量肉汤稀释法的检测结果，影响结果的准确性；而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比，MTT法检测的活菌吸光度值明显增加，t检验结果显示差异均有统计学意义（P＜0.05），说明MTT法可用于检测细菌活性，经离心后测定可排除死菌对吸光度值的干扰，其结果比微量肉汤稀释法更准确、特异性更高。（2）药敏结果显示当某株细菌对一种药物敏感时，MTT法测得的细菌存活率比用微量肉汤稀释法检测的细菌存活率更低；而当某株细菌对一种药物耐药时，MTT法测得的细菌存活率比用微量肉汤稀释法检测的细菌存活率更高，经统计学分析，皆有显著性差异（P＜0.05），说明MTT法不仅可用于细菌药敏检测，而且其敏感性和准确性明显优于微量肉汤稀释法。（3）另外本次MTT的检测时间点为加药培养后13 h，此时细菌增殖正处在对数生长期，更能准确的反应细菌的生长状
态，从而间接反应药物对细菌生长的影响，传统的微量肉汤稀释法检测的时间点是加药培养16~24 h，此时细菌生长可能已达平台期，即使药物对细菌的生长有一定的影响，但是因为培养的时间太长，而细菌的分裂周期很短，即少量的细菌也可能在培养16 h后达平台期，此时与未加药组相比几乎没有差别，从而使结论可能不太准确。从这点而言，与微量肉汤稀释法相比，MTT法明显缩短了药敏试验的时间，结果也更准确。
