木质纤维素糖化发酵工艺研究进展
前言
目前，世界乙醇生产主要以淀粉类(粮食作物为主，如玉米、木薯等)和糖类（如甘蔗、甜菜等）[1-2]作为发酵原料．采用微生物法发酵生产乙醇技术成熟，但是高昂的原料成本使粮食发酵生产乙醇的工业应用受到限制，同时存在与人争粮或与粮争地等弊端，并且导致粮食价格持续走高，因此寻找新的原料势在必行．所以现在科学家把目光投向成本更为低廉、来源更广泛的木质纤维素原料行严[3]．它不仅包括秸秆等农业废弃物，城市固体废弃物、办公废纸、杂草、锯末等以及市政废水中的固体部分[4].
地球上每年植物光合作用的生物量可达2 000亿 t，其中大部分为木质纤维素类．它的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素．在植物组织中木质素与半纤维素以共价键形式结合，并将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物很难进入使其降解。木质纤维素原料生产燃料乙醇的过程主要包括预处理、糖化、发酵等，其预处理是生物转化的关键步骤，影响整个纤维素酒精生产过程．因此高效、便捷的预处理技术是木质纤维素原料生产燃料乙醇的关键所在．
一、分步糖化和发酵（SHF）
前处理后的木质纤维素经水解糖化生成葡萄糖，然后在另一反应器中进行发酵转化为乙醇，这种糖化发酵工艺被称为分步糖化和发酵。其主要优点是糖化和发酵都能在各自最优条件下进行——纤维素酶水解糖化所需的最适温度在 45～5℃，
而大多数发酵产乙醇的微生物最适温度在 28～37 ℃[5]。缺点是糖化产物葡萄糖和纤维二糖的积累会抑制纤维素酶的活力，最终导致产率的降低。研究发现，纤维二糖的浓度达到 6 g/L 时，纤维素酶的活力就将降低 60%，葡萄糖对纤维素酶的抑制作用则没有那么明显，但是，它会对 β-葡糖苷酶（一种关键的纤维素水解酶）产生强烈的抑制，葡萄糖浓度达到3 g/L时，β-葡糖苷酶的活力就将降低75%。此外，水解用的纤维素酶（主要来自于真菌）不仅组分相对单一而且价格昂贵，当其活力受到抑制时，就得增加用量，最终导致使用成本的提高。最近，报道了一种新颖的糖化酶生产方法，在Verma 等[6]烟草叶绿体中表达木质纤维素糖化所需的酶，用其处理滤纸后所产葡萄糖的量是商业组合酶的 36.25倍，木质纤维素发酵系统的高成本和低产量也许会由此得到解决。爱的密方
二、同时糖化和发酵（SSF）
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为了克服 SHF 的缺点，Gauss等[7] 于1976 年在一项专利中首次提出了同时糖化和发酵（SSF）工艺，即在一个容器中同时进行这两步反应。水解产生的葡萄糖立即被发酵微生物利用以产乙醇，消除糖对纤维素酶的产物抑制作用，进而减少纤维素酶的用量，缩短反应时间，而且免去了 SHF 的固液分离操作，避免还原糖的损失，同时，去掉一个反应器，降低投资成本，据报道，成本可降低20%以上[8-9]。由于葡萄糖被维持在较低水平，乙醇的存在以及发酵处于一个厌氧环境，虽然运行温度不高，但SSF 感染杂菌的机会较小。最重要的是它提高了乙醇产量，通常比 SHF 千里送人头增加 40%[10]。对此的一种解释是 SSF 中的发酵菌株对抑制物的耐受力较好，能将其转化为毒性较低的化合物[11]。但也有 SHF 比SSF 运行得好的报道。
SSF 作为目前广泛应用的工艺，已有不少学者对其进行数学建模，以期深入了解其运行过程。这些数学模型大多表明，SSF 的性能决定于三方面——底物特性、水解酶特性和发酵微生物特性，而且，SSF 的限速步骤在反应初期表现为发酵微生物的生长，之后则是酶水解糖化，其中最关键的是酶对纤维素的可接触性[12]。Ko 等 [13]根据 SSF 的数学模型，对反应容器进行一段时间的通风，有助于发酵微生物的生长，从而缩短其限速时间，
结果提高了乙醇的产生速度，这应该与发酵微生物的生长良好有关。通过建模，还可寻找最佳的酶和发酵菌
的用量[14]。可见，数学模型的建立对于促进木质纤维素的生物处理效果比较重要。
3、SSF 工艺的缺点
主要是糖化和发酵的最优温度和 pH 值不同，不能同时满足，从而不能使两步都处于最佳状态。相对于温度差异，两者的 pH 值差异较小，对过程的影响也就相对弱些，所以关键就是温度的选取[15]。现在多采用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在高于40℃的温度下就会失活，于是它将温度限制在了 37 ℃左右，这样纤维素酶活力降低，多糖的水解速率也随之减慢。对于这些问题，有两种解决方法。第一种，选高温的高产发酵菌株。克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）能在 42℃的高温下发酵，Tomas-Pejo 等[16]Kluyveromyces marxianus CECT 10875 对经前处理的麦秆进行 SSF，得到乙醇浓度 36.2 g/L。第二种方法则是改进工艺，如不等温同时糖化和发酵（NSSF），循环温度同时糖化和发酵（CTSSF）等，与传统 SSF 中的等温相比，这些改进强化了纤维素酶的水解作用。
Wu等[17]运用 NSSF，首先在 50℃下进行水解糖化反应，然后在 20～30℃发酵，提取乙醇后又将发酵液回流到水解糖化容器中，如此循环，与相应的磁芯大战 SSF 相比，不仅加快了多糖的水解，减少了30%～40%红烧梭子蟹的纤维素酶用量，而且提高了产量，缩短了反应时间。Chen等采用 CTSSF（先 42 ℃下水解 15 min，然后在 37℃下进行 SSF 10 h，重复此过程），72 h后，与相应的 37 ℃ SSF 相比，乙醇产量提高 50%。
现在已报道不少关于基因重组后能利用木糖产乙醇的微生物，部分乙醇产率还较高。其中，S. cerevisiae 作为最常用的乙醇发酵菌，有较高的乙醇产量和产率（最优条件下，产量为 0.45 g/g，产率为 1.3 g/g·h），对乙醇和抑制物的耐受力也较细胞好，曾有报道能耐 100 g/L 乙醇的 S. cerevisiae 菌株。但是，野生的 S. cerevisiae 不能利用木糖产乙醇，仅能少量地将其还原为木糖醇。为了能使用[18]S. cerevisiae进行共发酵，Karhumaa等将编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的基因插入其基因组，得到乙醇产率为 0.13 g/(L.h)的基因重组菌株。但木糖
还原酶所依赖的共底物 NADPH 存在不完全循环，[19]会导致木糖醇积累。于是 Petschacher等运用基因定点突变使木糖还原酶转为以 NADH为共底物，与
未突变的重组菌株相比，同时对20 g/L木糖发酵后，含有突变木糖还原酶的重组酵母乙醇产量提高[20]42%。Kuyper等介绍了木糖异构酶在 S. cerevisiae
中的异源表达，最终获得乙醇产量为 0.42 g/g的木糖基因重组菌株。因此，Z. mobilis也被作为基因重组的目的菌。早期的研究主要是将木糖异构酶和木糖醇激酶的基因转入 Z. mobilis，但由于较低的转酮醇酶和转酰酶活力，所得重组菌不能在以木糖为唯一碳源的培养基上生长。之后，[21]Zhang等将编码木糖利用和PPP途径有关酶的两个操纵子导入 Z. mobilis，得到能有效发酵葡萄糖和木糖的改造菌。McMillan 等[22]能源实验室的重组进行北美鹅掌楸的己糖戊糖共发酵，7天总糖转化率达到 54%。此重组Z. mobilis 中导入了来自大肠杆菌的编码木糖异构酶、木糖醇激酶、转酮醇酶和转酰酶的基因，木糖在此重组菌中经这4种酶的作用转变为6-磷酸果糖和 3-磷酸甘油醛，从而进入 ED 途径产乙醇。但是，这些菌株主要是用可溶性糖作为底物筛选出来的，在这种条件下，糖浓度较高，生长也快，与 SSCF 中低糖浓度和高的底物浓度的情况不相符。一个好的可溶性糖发酵微生物不一定是好的SSCF 菌株，因为用于 SSCF 的菌不仅要求能较好的发酵戊糖和己糖，还要对乙醇和其它抑制物有较好的耐受力。
盐的作用
Bertilsson 等[23]在酶水解糖化之前对底物中的葡萄糖进行了前发酵，从而提高了木糖的利用。采用补料发酵使发酵液中的葡萄糖保持在较低的浓度，对木糖的发酵很有利。Chandrakant等还介绍了其它方案，包括加入木糖异构酶，酶和细胞的固定化，接种木糖发酵微生物与葡萄糖发酵微生物共同作用等[24]。Fu 等利用 Z. mobilis 和毕赤酵母共同发酵葡萄糖和木糖混合物，乙醇产量达 0.49～0.50 g/g，与目前最好结果相差不大。当然，也可通过数学模型的建立来优化此工艺[25]。Zhang 等介绍了 SSCF 的数学模型，指出水解糖化相关常数中纤维素的水解常数最为重要，而发酵相关常数中最重要的是乙醇产量和微生物的乙醇耐受力。
四、木质纤维素的产业化
人口的暴增使得大面积种植粮食作物成为必须，这就为木质纤维素乙醇的生产提供了大量原料，以满足日益增长的能源需求。目前的木质纤维素产乙醇工艺还不成熟，无法达到工业化水平。对于所有的工艺来说，最大的挑战仍是获得尽可能好的糖化效果和乙醇产量，所以对于高产的共发酵微生物和高效水解酶的研究仍将继续，不过对于这些研究成果的过程经济评估也是必须的。其中，广为使用的 SSF 工艺虽然带来了较大突破，但始终存在生
产成本过高、工艺不够简化等问题。利用基因工程术对 E. coli、Z. mobilis、S. cerevisiae进行改造，构建出一系列能够发酵木质纤维素水解产物（木糖、葡萄糖）的基因重组菌株，以提高发酵木糖和葡萄糖转化乙醇的能力，成为目前 SSCF 研究和开发的[26-27]重点。白蚁肠道也是一个高度发达的天然纤维素降解系统，Droge 等[28]从白蚁后肠分离到一种新的螺旋体，可以利用多种单糖、二糖和寡糖进行发酵产乙醇。未来研究可关注设计合适的筛选方法从白蚁肠道分离有价值菌株，最后，经济的木质纤维素乙醇的生产需要简单的原料预处理方法、低的能量投入、高的转化效率，而且如果能进行其它高附加值产品的共生产，如黏合剂和动物饲料（可由发酵剩余物制成），其产业化不难实现[29]。
参考文献：
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[5] Taherzadeh M J.Karimi K.Enzyme-bad hydrolysis process for ethanol from lignocellulosic materials：A review[J]. Bioresources，2007,2（4）:707-738.
[6] Verma D.Kanagaraj A.Jin al. Chloroplast-derived enzyme cocktails hydroly lignocellulosic biomass and relea fermentable sugars[J]. Plant Biotechnology Journal，2010，8（3）：332-350. 什么是有机食品
[7] Olofsson K，Bertilsson M，Liden G. A short review on SSF An interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks[J]. Biotechnology for Biofuels，2008,1:7.
