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实验一、冻存细胞的复苏与传代培养（9学时）
一、清洗与灭菌
（一）实验目的
能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
六级考试时间分配（二）实验原理
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
（三）仪器、材料和试剂
仪器 超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。
材料 无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25 mm）：孔径为0.22μm，微孔滤膜（直径90 mm）：孔径为0.22μm，过滤器（直径25 mm）。
试剂 （参见附录4）
70%或75%酒精，0.1%新洁尔灭，煤酚皂溶液（来苏儿水），0.5%过氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸（工业），DEPC水[体积分数0.1%的碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）]。
（四）实验步骤
清洗
1．新玻璃器皿的清洗
先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗
（1）使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
英语三级试卷（3）浸酸性洗液过夜。
（4）从酸性洗液捞出后用自来水冲洗10～15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
ssa（5）包装（牛皮纸或一般纸）。
（6）高压（15磅20min）或干热（160℃ 2h）灭菌（见（二）消毒与灭菌）。
（7）贮存备用。
3．用于RNA提取的玻璃器皿的清洗
用于RNA操作的物品需经特殊处理以彻底去除RNA酶。
（1）洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍。倒置自然干燥。
kernel（2）浸酸性洗液过夜。
（3）从酸性洗液捞出后，自来水冲洗10～15次去除残余酸液。
针织衫怎么搭配（4）0.2mol/ L NaOH浸泡半日。
（5）清洗5～10次，蒸馏水涮洗3次，倒置晾干。勿使皮肤直接接触到被洗涤的物品（戴手套操作）。
（6）锡纸包装封口。
（7）干热灭菌180℃ 5～8h或湿热灭菌15磅以上40 min。注意：自第5步以后均应戴手套操作，勿用普通纸包装待灭菌物品，以免纸被烧焦。
4．胶塞的处理
（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2% NaOH煮沸10～20min。
（2）自来水清洗10次。
（3）再用1%稀盐酸浸泡30min。
（4）自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌（见（二）消毒与灭菌）。旧 胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
5．塑料制品的清洗
（1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍。
（2）次强酸洗液浸泡2～6h。
（3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水涮洗3次。
（4）浸泡在70%乙醇1 h以上，备用。
（5）临用前从70%乙醇中取出，在超净台内紫外线照射1 h左右方可使用。也可在洗净后不经70%浸泡，而用塑料袋包好，成箱地去照射60Co灭菌。
6．加样器头（Tip）和离心小管（Tube）的清洗
（1）新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水涮洗，晾干，高压灭菌后可以使用（方法同塑料制品）。
（2）当新的国产Tip和Tube用于RNA提取时，则用蒸馏水涮洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡过夜后晾干，高压灭菌后方可使用。
（3）使用过的Tip和Tube用完后应浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L 盐酸溶液中。用清水洗过，再用较稀的洗涤剂液在超声波清洗仪中超声处理30min。自来水清洗5～6遍后，再用次强洗液浸泡2～24h。自来水逐个充分冲洗并用蒸馏水涮洗，晾干，放入Tip架或饭盒内高压灭菌。
7．洗液的配制
常用的洗液是硫 — 重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制成不同的强度（表1-1）。
表1-1 常用的洗液配方
成 分 | 强 酸 洗 液 | 次 强 酸 洗 液 |
重铬酸钾 | 63g | 3150g | 120g | 6000g |
浓硫酸（工业） | 1000mL | econ50000mL | 200mL | 10000mL |
蒸馏水 | 200mL | 应试教育英文10000mL | 1000mL | 50000mL |
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配制方法：
（1）将重铬酸钾放人大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。
（2）将重铬酸钾液倒人酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分混合溶解。操作时务必注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液溅到皮肤和衣物上。万一不慎溅到皮肤上应立即用大量清水冲洗。
消毒与灭菌
1．物理消毒法
（1）射线消毒灭菌
主要使用60Co、X射线进行消毒灭菌，可用于牛血清和塑料制品的灭菌。简称英文
（2）紫外线消毒
用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。
① 消毒方法 现在一般用无臭氧型紫外灯。消毒的效能与距离成反比，因此应根据消毒的目的适当设置消毒距离：进行空气消毒时灯管应距地面2.5 m以内；台面的消毒应在80cm以内；培养器皿的消毒在30cm以内。
消毒的时间与效能存在一定关系，但不是绝对的：照射20min后，约有71%的细菌被消灭；40min后79%的细菌被消灭；60min后86%的细菌被消灭。紫外线照射时间再长也不是100%的灭菌，最多只能把90％的细菌消灭，过长的照射是没有意义的。故单独使用时，一般只用于空气和台面的消毒。如仅用紫外线照射带菌的器皿，则无法彻底灭菌，所以应与其他消毒方法结合使用，如先用75%的酒精浸泡，再照紫外线消毒灭菌等。
② 检查消毒灭菌效果 照射后为检查超净台是否达到无菌效果，可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放置5个含琼脂糖半固体培养基的直径90mm培养皿，20min后再转入37℃培养箱中培养72h，观察细菌生长情况。如果每块平皿上无菌落生长，说明洁净台符合无菌标准。
（3）干热灭菌
主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90～120min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5～8 h。
（4）湿热灭菌
此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS、20x SSC等）。手动高压灭菌锅操作如下：
① 首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。
② 加热高压锅。将放气阀打开，放气5～10min，以排除锅内的冷空气。
③ 待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅（121℃）30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115℃）20min。调节火力大小保持该压力。
④ 停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。
如：电热自动灭菌锅使用说明（型号：SANYO Autoclave MLS-3020）：
① 放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。
② 打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1/3～2/3处。
③ 打开电源。
④ 设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105～121℃，高压灭菌一般采用121℃ 20～30 min。
⑤ 把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至clo位置。
⑥ 关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。
⑦ 按start钮，开始高压，在温度达80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0MPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至80℃时，蜂鸣器报警1
0次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。
⑧ 关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。
（5）滤过除菌
用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm……等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20mm、25mm等）。滤膜孔径有0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm等，以0.22μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
① 在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。
② 用布包好，湿热灭菌后使用。
2．化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
（1）70%（或75%）酒精：超净台里常备70%酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
（2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。
（3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷洒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。
（4）0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷洒和擦拭方式进行。
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（5）乳酸蒸气：将乳酸放人坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1～3d。可将空气中漂浮的微生物杀死。
（6）37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后
断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸汽。1～3d后方可达到消毒空气的目的。
3．煮沸消毒
急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。
（五）注意事项
1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10～15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。
