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中南大学
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rAAV载体介导人凝血因子IX基因治疗血友病B的研究
姓名：***
英语字帖申请学位级别：博士
专业：内科学
指导教师：***
20040501
lowa是什么意思摘要
血友病Ｂ是一种遗传性出血性疾病，因患者血液中缺乏凝血因子Ⅸ而导致严重的凝血功能障碍。该病为ｘ染色体连锁隐性遗传，在男性中发病率约三万分之一。常规的治疗方法为替代治疗，在发生出血时进行静脉输注血液或血液制剂（凝血酶原复合物、浓缩人ＦⅨ）。患者需要反复输血或血液制品，不仅费
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用昂贵，更为严重的是极易导致ＨＢＶ、ＨＣＶ以及ＨＩＶ等感染。九十年代以来，基因重组Ⅸ因子的出现为血友病患者的治疗增加了安全系数，但不能改变患者反复注射、终身用药、费用昂贵的问题，并不能从根本上治疗血友病Ｂ。
心情压抑基因治疗是二十世纪八十年代以后发展起来的一种全新的疾病治疗模式，而血友病Ｂ是目前最适合基因治疗病种之一，基因治疗有望从根本上治愈血友病Ｂ，使病人在得到预防性治疗效果的同时而不用长期频繁接受凝血因子注射。而选择一种安全、高效的基因转移载体是基因治疗成功的关键。重组腺相关病毒载体（ｒＡＡＶ）因具有安全性好、能感染多种类型细胞、可介导外源基因长期表达等特点，是目前较理想的基因治疗载体之一，我们选用了ｒ从Ｖ作为血友病Ｂ基因治疗研究的载体，希望能达到从根本上治疗血友病Ｂ的目的，为此我们构建了携带人凝血因子ＦＩＸ（ｈＦＩＸ）的从Ｖ的包装质粒，并制备了高纯度的ＡＡｖ病毒，在体外培养细胞和正常小鼠中得到了有效的表达，特别是在血友病Ｂ模型小鼠体内得到了有效的表达，使血友病Ｂ模型小鼠的凝血功能得到了显著的改善，为ＡＡＶ载体的临床应用奠定了基础。
图书馆英语本研究以通用的腺相关病毒质粒ｐＳＮＡＶ—ｉ为基础，构建成分别以ＣＭＶ和ｈＥＦＩＱ为启动子含ｈＦⅨ基因或荧光素酶（ＬＵＣ）报告基因的４种重组质粒，转染ＢＨＫ－２１细胞，经Ｇ４１８选择培养，分别得到包装病毒用的载体细胞株。再用ｒＡＡＶＩ和ｒＡＡＶ２各自的包装辅助病毒感染载体细胞株，包装并纯化后得到６种高纯度的重组ＡＡＶ病毒。并制备了４株抗ｒＡＡＶ２的单克
隆抗体。
研究了ｒＡＡｖｌ／ｃＭｖ—ＬＵＣ和和ｒＡＡｖ２／ｃＭｖ—Ｌｕｃ在体外培养细胞中的转导特性，包括转导不同哺乳动物细胞ＬＵＣ表达量及量效关系、肝素对转导细胞ＬＵＣ表达的拮抗作用、ｒＡＡＶ自身竞争抑制作用、丁酸钠对转导细胞ＬＵＣ表达水平的作用和ｒＡＡＶ２抗体对ｒＡＡＶＩ和ｒＡＡＶ２转导细胞的影响。实验表明：这两种血清型在不同培养细胞中ＬＵＣ表达量不同，有不同的细胞亲嗜性，随着ＭＯＩ（ｖ．ｇ．／ｃｅｌｌ）增加，ＬＵＣ的表达量相应提高，但是超过一定的量时，表达量反而下降，存在饱和抑制现象。ｒＡＡＶＩ和ｒＡＡＶ２自身存在竞争抑制作用；肝索对ｒＡＡＶ２转导有拮抗作用，但对ｒＡＡＶＩ无影响。丁酸钠能明显增强ｒＡｈＶｌ和ｒＡＡＶ２携带的ＬＵＣ基因在转导细胞的表达水平。只有其中２株ｒＡＡＶ２单抗具有中和活性，但全都与ｒＡＡＶＩ不发生交叉反应。
本研究比较了ｒＡＡＶ２／ＣＭＶ—ｈＦＩＸ和ｒＡＡＶ２／ＥＦｌａ－ｈＦＩＸ（ＭＯＩ为ｉ０５）转导体外培养ＨｅｐＧ２细胞的ｈＦⅨ表达。分析了ｒＡＡＶｌ／ＣＭｖ＿ｈＦⅨ和ｒ从ｖ２／ｃＭｖ—ｈＦＩＸ（ＭＯＩ为１０５）转导体外培养Ｃ２Ｃ１２细胞以及不同剂量肌肉注射正常小鼠的体内ｈＦⅨ表达水平。并将不同剂量ｒ从Ｖ２／ＣＭｖ—ｈＦＩＸ多点肌肉注射血友病Ｂ模型小鼠，检测了血浆中ｈＦＩＸ表达量、ＦＩＸ凝
ＩＩ
血活性、５分钟失血量及载体生物分布等指标。结果表明：ｒ从Ｖ２／ｈＥＦｌａ—ｈＦⅨ和ｒ从Ｖ２／ｃＭｖ－ｈＦⅨ在体外培养的ＨｅｐＧ２细胞中也无显著差别（Ｐ＞Ｏ．０５），均检测到有较高水平ｈＦⅨ表达，２４ｈ最高表达量分别为６７±２．５ｎｇ和５８±３．６ｎｇ；ｒＡＡＶｌ／ＣＭｖ—ｈＦⅨ和ｒ从Ｖ２／ＣＭｖ＿ｈＦⅨ转导Ｃ２Ｃ１２细胞，ｈＦⅨ表达量也无显著差别（Ｐ＞Ｏ．０５），２４ｈ最高表达量分别为８０±５．２ｎｇ和６８±４．３ｎｇ，直接肌肉注射正常小鼠后第３周达到高峰期，同一剂量ｒＡＡｖｌ／ＣＭｖ＿ｈＦⅨ小鼠血浆中ｈＦⅨ水平显著高于ｒＡＡｖ２／ＣＭｖ—ｈＦⅨ组，有显著差别（Ｐ＜Ｏ．０１），其中高剂量组（２．５×１０”ｖ．ｇ．／ｋｇ）最高表达量分别为２００±１２．３ｎｇ／ｍｌ和４０±５．６ｎｇ／ｍｌ血浆。ｒＡＡｖ２／ｃＭｖ—ｈＦⅨ经肌肉直接注射到血友病Ｂ模型小鼠后，在体内能够高效表达ｈＦⅨ，第３周达到高峰，然后缓慢下降，第１０周仍可检测到低水平ｈＦⅨ表达。高（１．２５×１０”ｖ．ｇ．／ｋｇ）、中（２．５×１０”ｖ．ｇ．／ｋｇ）和低（５×１０“ｖ．ｇ．／ｋｇ）剂量组最高表达量分别达到３６４±２０ｎｇ／ｍｌ、２５８＿＋１７ｎｇ／ｍｌ和１７６±８ｎｇ／ｍｌ血浆，各不同剂量重组病毒注射组的小鼠血浆中ｈＦＩＸ的表达量均与对照组之间差异显著（Ｐ＜Ｏ．０１），第３周小鼠血浆样品凝血功能检测，高、中和低剂量组凝血因子Ⅸ活性均得到明显改善，分别达到正常的３０．５３±５．４％、１３．２３±２．９２％、１０．３±２．６３％，与阴性对照组（２．３±１．７％）比较有显著差异（Ｐ＜０．０１），５分钟失血量也相应显著减少，高、中和低剂量组分另０为５０．３３±１５．４６ｕ１、７２．４８±１７．０２ｕ１署口９８．３６±２０．２３ｕ１，与
阴性对照组（４２８．３３±５１．６９ｕ１）比较有显著差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。给药后第１０周，除在注射点外，其它主要脏器均未检测到检测到ＡＡＶ载体
ｌｌＩ执著的意思
ＤＮＡ。
美剧排行本研究表明：ｒＡＡＶＩ转导细胞可能是通过多个受体所介导，ＨＰＳＧ不是ＡＡＶＩ的受体，ｒＭＶｌ和ｒＡＡＶ２有不同细胞和组织亲嗜性。当ｒＭＶｌ和ｒＡＡＶ２携带的外源基因表达量较低的情况下，丁酸钠刺激能增强基因表达，提高检测的灵敏度。ｒＡＡＶｌ与ｒＭＶ２转导的ＭＯＩ（ｖ．ｇ．／ｃｅｌｌ）超过一定范围，其转导基因的表达量反而有所降低，存在过量抑制现象。ｒＡＡＶ２／ｈＥＦＩａ－ｈＦＩＸ转导体外培养ＨｅｐＧ２细胞，有较高水平ｈＦⅨ表达；ｒＡＡＶＩ介导ｈＦⅨ在肌肉中表达量明显高于ｒＭＶ２，为我们采用ｒＡＡＶＩ肌肉途径及ｒＡＡＶ２肝脏给药途径基因治疗血友病Ｂ的进一研究打下了初步的基础。ｒＡＡＶ２／ＣＭＶ＿ｈＦⅨ多点肌肉注射能有效治疗血友病Ｂ模型小鼠，为ｒＡＡｖ２／ｈＦⅨ进入基因治疗血友病Ｂ临床试验奠定了坚实的基础。
关键词重组腺相关病毒，人凝血因子Ⅸ，血友病Ｂ，基因治疗，转导特性
