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（收稿日期：2020-05-18）
·论 著·
“抗帕颗粒”通过泛素-蛋白酶体途径对
highlight是什么意思帕金森小鼠α-syn异常聚集的影响
颜 静 赵晓晖 王永兵 张丽娅 刘慧琴
【摘要】 目的 探讨中药“抗帕颗粒”通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）影响帕金森病（PD）小鼠黑质纹状体区α-突触共核蛋白（α-syn）异常聚集的可能机制。方法 采用C57BL/6小鼠作为实验动物，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）腹腔注射制模，随机分为：I组（正常对照组）、II组（PD对照组）和III组（PD“抗帕颗粒”干预组），每组30只。第III组“抗帕颗粒”灌胃浓度800mg·mL-1，剂量40mg·kg-1·d-1，第I、II组予生理盐水1ml·d-1灌胃，分笼喂养4个月。处死后取标本Western blotting法检测各组黑质纹状体区α-syn、泛素羧基端水解酶-1（UCH-1）、Parkin蛋白量的表达。结果 ①90只小鼠中87只存活4个月，分别为第II组死亡2只，第III组死亡1只；第II组13.33%（4/30）、第III组10.00%（3/30）在制模7~14d内出现一过性低体温（肛温<33.0℃）。两组以上表现及持续时间无
显著性差异，P>0.05；②α-syn蛋白定量：第I组、II组比较，P<0.01；第I组、III组比较，P＜0.05；第II组与第III组比较，P＜0.05；③UCH-1、Parkin蛋白定量：第I组、II组比较，分别为P<0.01、P<0.05；第I组、III组比较，分别为P＜0.01、P<0.05；第II组与第III组比较，分别为P＜0.001、P<0.01。结论 “抗帕颗粒”通过UPS途径抑制PD小鼠黑质纹状体区α-syn的异常聚集，其中阻断氧化应激反应可能是这种保护作用的关键机制，但不能完全逆转PD的病理改变。
【关键词】 帕金森病；小鼠模型；“抗帕颗粒”； 泛素-蛋白酶体系统；α-突触共核蛋白
中图分类号：R742.5 文献标识码：A 文章编号：1006-351X（2020）11-0692-06
基金项目：上海市浦东新区科委科技发展基金民生科研专项（PKJ2017-Y32 ）；上海市浦东新区医学重点学科建设项目（PWZxk207-11）
作者单位：201200 上海，上海市浦东新区人民医院神内二科（颜静、赵晓晖、刘慧琴）；普外科（王永兵、张丽娅）
通信作者：赵晓晖，Email:********************
The effect of‘Anti-Parkinson granule’on the abnormal aggregation of α-syn through ubiquitin proteasome system in the Parkinson dia mou model
Yan Jing,Zhao Xiaohui, Wang Yongbing, Zhang Liya, Liu Huiqin Department of Neurology, the Shanghai Pudong New Area People’s Hospital, Shanghai 201200, China
Correspondingauthor:ZhaoXiaohui,Email:********************
[Abstract] Objective To find out the possible mechanism of that‘Anti-Parkinson dia granule’makes effects on the abnormal accumulation of α-syn through UPS in the Parkinson mou model. Methods As animals for experiment, C57BL/6 mou were intraperitoneally injected by MPTP (40mg·kg-1·d-1×7) to make PD model, and they were divided into three groups randomly: group I (normal control group), group II (PD model control group) and group III (PD model intervention group) with 30 mou in each group. The group III were gavaged with ‘anti-Parkinson granule’ (40mg·kg-1·d-1) for 4 months. Using Western blotting , the expression levels of α-synuclein （α-syn）, ubiquitin carboxyl terminal hydrola-1 （UCH-1）and Parkin proteins in the substantia nigra striatum area of each group were compared and analyzed at the end of the fourth month. Results ①After 4 months, 87 mou were survived, 2 died in the group II and 1 died in the group III. 13.33 percent（4/30）of group II,10.00 percent（3/30）of group III occured hypothermy during the 7-14 days. There was no significant difference between the two groups, P>0.05;②The expression of α-syn protein: the comparison between group I and group II was P<0.01, between group I and group
III was P < 0.05, and between group II and group III was P < 0.05. ③The expression of UCH-1 and Parkin proteins: between group I and group II , P<0.01 and P<0.05 respectively, between group I and group III were P< 0.01 and P<0.05, and between group II and group III were P< 0.001 and P<0.01. Conclusion ‘Anti-Parkinson granule’ has an inhibitory effect on the abnormal aggregation of α-syn in the substantia nigra striatumregion in PD mou, which is partly related to the improvement of UPS function. The protective effect can be delivered by blocking oxidative stress respon. Howerever,‘Anti-Parkinson granule’can’t rever the pathology of PD completely.拼音字母写法
[Keywords] Parkinson's dia; Mou model; Anti-Parkinson granule; Ubiquitin-proteasome system; α-synuclein.
本研究对课题组自行开发传统组方研制的“抗帕颗粒”，从帕金森病（Parkinson’s dia, PD）的重要发病机制——泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）功能障碍影响异常聚集的α-突触共核蛋白（α-synuclein，α-syn）降解并损伤多巴胺神经元出发，深入探讨“抗帕颗粒”的作用靶点，为“抗帕颗粒”治疗PD提供实验依据。quiet怎么读
材料与方法
1. 实验动物和检测试剂
SPF级C57BL/6健康小鼠，雄性，鼠龄10~14w，体质量20~22g，由上海灵畅生物科技有限公司供应[SCXK（沪）2018-0003]，由复旦大学药学院实验动物中心喂养[SYXK（沪）2015-0023]；均饲养于20～24°C环境中。
我们撞到外星人实验药物“抗帕颗粒”批准号（2001）02-050，美国Sigma公司提供1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1,2,3,6-Tetrahydro-1-methyl-4-phenylpyridine MPTP），CST公司提供小鼠抗大鼠α-syn单克隆抗体（广州，4179S），Proteintech 公司提供小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena,GAPDH）单克隆抗体（美国，6004-1-Ig），兔多克隆泛素羧基端水解酶-1（ubiquitin carboxyl terminal hydrola-1, UCH-1）抗体、Parkin抗体购自PTG公司（武汉，66230-1-Ig、14060-1-AP）；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗由中杉金桥公司提供（北京，ZB2301、ZB2305）；BIOSHARP公司（合肥）提供聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量试剂盒；ChemiScope 5300 Pro公司（上海）提供一体式化学发光成像仪。
2. 动物实验分组
采用C57BL/6小鼠作为实验动物，随机分为：I 组（正常对照组）、II组（PD对照组）和III组（PD“抗帕颗粒”干预组），每组30只。第III组“抗帕颗粒”灌胃浓度800mg·mL-1，剂量40mg·kg-1·d-1，第I、II组予生理盐水1ml·d-1灌胃，分笼喂养4个月。每周按体质量调整给药量。
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4个月时第I组30只均存活；第II组存活28只，1只为低体温（第10天30.5℃）死亡，另1只进食逐渐减少衰竭死亡（第68天）；第III组存活29只，1只亦为低体温（第12天31.2℃）死亡。
3. PD小鼠模型制备
第II组及第III组小鼠予MPTP腹腔注射，MPTP剂量40mg·kg-1·d-1×7d[1]，第I组小鼠每只给以生理盐水0.1ml·d-1×7d腹腔注射。
4. 实验取材
喂饲4个月后，取第I组15只、第II组14只、第III组15只经麻醉断头取脑。黑质确认方式见图1：①确认人字点：人字点位于前卤点-4.2mm即红色箭头位置；②确认黑质位置：黑质位于横轴前卤点-2.46mm至-4.16mm即上图蓝色区域内，右方纵轴3.9mm至4.8mm即上图绿色区域内，上图黄色区域内为黑质部位，考虑黑质不是规则图形，实际拍照会以脑剖图上位置为准；③裁剪组织：按蓝色框左右两条线为切面，往两边多预留一些位置用于裁剪，从人字点按冠状面切下组织，再用游标卡尺往嗅球方向确认1.8mm 处再按冠状面切下。
A：矢状面
B：冠状面
图1 黑质定位方法
5. Western blotting 检测样品准备与蛋白定量
将上述组织按照要求每组各称取0.01g，并剪碎组织；加入预冷的放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液混匀，裂解后离心10 min，取上清蛋白质定量，贮存于-80℃冰箱。根据样品数量以体积比50:1配制BCA工作液，各孔加入工作液200 μl；振荡酶标板30 c，37℃放置30 min，测定（562nm下）。以光吸收值为纵坐标，蛋白浓度（mg·mL-1）为横坐标，绘出标准曲线；在酶标板中加入17.5μl 聚丁二酸丁二醇酯（poly
butylene succinate,PBS）、2.5μl待测蛋白和工作液200μl，同上方法振荡、放置、测定光吸收值；根据所测样品的光吸收值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(mg·mL-1)。根据样品浓度确定上样量。
6. α-syn 、UCH-1、Parkin蛋白量的表达检测
上样电泳：制备聚丙烯酰胺电凝胶（polyacry lamide gel electrophoresis,，每孔上样30μg蛋白，根据蛋白定量结果取所需蛋白，加入缓冲液后沸水浴10min，离心取上清上样；向电泳槽中的PAGE胶加入缓冲液时为避免孔内有余胶残留影响上样需用枪吹打加样孔；向对应的孔内缓慢加入样品（浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min）；当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。
转膜：将胶移入缓冲液，剪下硝酸纤维素膜（nitrocellulo filter membrane,NC）（需同样大小），甲醇中浸泡3min，再水洗2min；再剪下6块同样大小的NC膜与滤纸，缓冲液中平衡15min；转膜装置上从负极到正极依次放置垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、垫片，除去气泡。恒流200mA，以每1千道尔顿（Kilodalton,KD）转膜1min的时间计算。
蛋白检测：为检测转膜是否成功先予丽春红染色：2%的丽春红贮备液1:10稀释，将膜放入三异丙基乙磺酰缓冲氯化钠（tris buffered saline tween,TBST）洗一次后置于丽春红染色工作液中，摇动5min，直至水变无色且蛋白条带清晰，甲醇再活化聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF），TBST洗后封闭。
封闭膜及孵育抗体：5%脱脂奶粉室温封闭1h 或4℃过夜。一抗：根据说明书加入封闭液中稀释到所需浓度，4℃孵育过夜；二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次10min。按1:5000根据用量稀释HRP标记的二抗，37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次10min。
7. 一体式化学发光仪拍摄照片
胶片曝光8~10 min，显影、定影。
8. 统计学方法
统计软件采用SPSS19.0（SPSS Inc. Chicago, IL）。计数资料用n（%）描述，两组间比较采用x2检验；计量资料服从正态分布，以x-±s表示，组间比较采用t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.PD造模情况（表1）
表1 第II 组、第III 组小鼠造模后表现及持续时间组别PD 对照组（n =30）PD 干预组(n =30)
造模后表现
n 每次持续时间n 每次持续时间兴奋2912.45±2.18 min 3011.97±2.04 min 震颤2646.87±2.76 min 2548.11±2.91 min 活动减少
24
12.95±2.08 h
24
14.02±2.17 h
第II 组、第III 组小鼠每次注射MPTP 后，表现为短时兴奋，四处窜跳；随即出现数10min 的全身中重度震颤，伴有毛发和尾巴竖立；随后24h 内出现活动减少（见表1）；另外，两组分别有13.33%（4/30）、10.00%（3/30）在制模7~14d 内出现一过性低体温（肛温<33.0°C）。两组表现及持续时间无显著性差异。
2. 蛋白定量标准曲线（图2）
浓度(mg ·mL -1
)OD 值OD-OD
00.04500.250.1010.0560.500.1170.0720.750.1610.1161.000.200.155
1.25
0.2270.1821.50
0.251
0.2061.750.2930.248
被动语态讲解
A：蛋白标准曲线 B：光吸收值与蛋白定量
如上图所示，根据样品浓度确定上样量；根据所测样品的光吸收值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(mg·mL -1)。
3.各组小鼠黑质纹状体区Western blotting 检测α-syn 蛋白表达情况见图1、图4
图1 各组小鼠α-突触共核蛋白（α-syn）蛋白定量分析，a P <0.01，
b
P <0.05，c P <0.05
显示第III 组与PD 模型组比较α-syn 有所降低，P <0.05；
但第III 组与第I 组比较，α-syn 亦显著增加，P <0.05。
4.各组小鼠黑质纹状体区UCH-1蛋白含量的测定情况见图2、图4
图2 各组小鼠泛素羧基端水解酶-1（UCH-1）蛋白定量分析，
a
P <0.01，b P <0.001，c P <0.01
第III 组较PD 模型组UCH-1蛋白含量显著增加，
P <0.001；
且第III 组较第I 组亦显著增加，P <0.01。5. 各组小鼠黑质纹状体区Parkin 蛋白含量的测定情况（图3、图4）
图3 各组小鼠Parkin 蛋白定量分析，a P <0.05，b P <0.01，c P
<0.05
对照组 模型组 干预组α-突触共核蛋白
泛素羧基端水解酶-1
Parkin 蛋白
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
图4 各组小鼠α-突触共核蛋白（α-syn）、泛素羧基端水解酶-1
（UCH-1）、Parkin 蛋白含量变化
显示第III 组较PD 模型组Parkin 蛋白含量显著增加，P <0.01；且第III 组较第I 组亦有所增加，P <0.05。
讨 论
在PD 的基础研究中，MPTP 作为神经毒素腹腔注射制备PD 小鼠被认为是较理想的制模方法[2]。然而需要提出的是，本研究在制模过程中发现，60英语四六级考试官网
对照组 模型组 药物组
α-突触共核蛋白/甘油醛-3-铃酸脱氧酶
对照组
模型组药物组
对照组 模型组 药物组
对照组模型组药物组
泛素羧基端水解酶-1/甘油醛-3-铃酸脱氧酶
对照组 模型组 药物组
对照组模型组药物组
buck
P a r k i n /甘油醛-3-铃酸脱氧酶
蛋白浓度（mg ·mL -1）
只C57BL/6小鼠制模后次日即死亡11只，尸体解剖显示均为肠坏死，分析实验小鼠制模死亡的主要原因为腹腔注射深度过深，穿刺入肠腔，导致肠坏死致死亡；经补充实验动物、规范穿刺方法，60只C57BL/6小鼠PD制模顺利完成。因此，MPTP注射的深度及手法直接关系到制模的成败。
从PD的发病机制分析，氧自由基与PD发病密切相关。PD患者处于氧化应激状态，脑黑质中固醇类过
氧化物较正常人增多10倍，因此，预先给予抗氧化剂或含巯基的化合物可不同程度地改善PD病理改变[3]。“抗帕颗粒”由8味中药组成，包括：熟地、生黄芪、山萸肉、僵蚕、红参、水蛭、全蝎、丹参，分析现代药理：熟地通过抵抗血清E2浓度，调节Na+-K+-ATPa的活性，具有一定的抗神经元凋亡的作用[4]；生黄芪除了阻止神经元凋亡因子Bax与Bak 发生寡聚化，并抑制caspa-3的活性，从而减少活性氧的产生而发挥抗凋亡作用外[5]；山萸肉可抑制白介素-2（IL－2）的产生和表达具有抗氧化作用[6]；僵蚕的主要药理成分是草酸铵，可显著提高机体免疫力并具有抗惊厥作用[7]；红参通过增强吞噬巨噬细胞的能力提高人体免疫力[8]，而且可以刺激轴突生长和诱导中枢神经干细胞的分化，能有效治疗细胞氧化损伤[9-10]；水蛭通过沉默信息调节因子1（silent mating type information regulation,Sirt1）信号通路降低白介素－1β（IL－1β）、白介素－6（IL－6）、白介素－12（IL－12）等炎症因子的表达[11]；全蝎通过促进正常巨噬细胞NO、TNF-Ot、IL-6分泌的作用增强免疫力[12]；丹参的抗氧化、抗氧自由基功能已得到充分证实[13]。综上说明，“抗帕颗粒”可通过抗氧化应激等机制，在PD治疗中起神经元保护作用[14]。但具体作用机制、靶点有待于深入研究，也是本研究的重点。
大量研究显示，α-syn的异常聚集是PD发病机制中最重要的因素，可溶性α-syn 向异常纤维状α-syn 转化是PD发病的关键环节，也是PD的各种诱发因素的共同通路[15]。因此，寻找一种能针对其关键环节进行阻断的手段可能是改变PD治疗现状并从根本上治疗PD的方向。本研究分组对照分析黑质部位α-s
yn蛋白量的表达发现，第I、II组比较，P<0.01，证实MPTP方法制模成功；第II、III组比较，P＜0.05，提示“抗帕颗粒”可抑制α-syn异常聚集，
对PD多巴胺神经元具有保护作用；第I、III组比较，P＜0.05，说明“抗帕颗粒”可一定程度改善PD小鼠α-syn的异常聚集，但仍不能完全逆转至正常，提示PD病理改变的非可逆性。
UPS是重要的非溶酶体蛋白降解途径，可通过清除突变及异常折叠的蛋白质，调控蛋白质的功能，α-syn即通过UPS降解，因此，UPS功能受损与PD的发病密切相关[16]。在UPS中，UCH-1和Parkin蛋白是UPS中重要的功能蛋白，可作为反映UPS功能状态的检测指标[17-18]。本研究检测UCH-1蛋白量的表达显示，第I、II组比较，P<0.01，证实UCH-1功能受损是PD发病机制之一；第II、III 比较，P＜0.001，显示“抗帕颗粒”可显著提高UCH-1蛋白量，从而加强对α-syn的降解；第I组与PD模型干预组比较，P＜0.01，显示“抗帕颗粒”干预可有效进一步提高UCH-1蛋白量，在PD的治疗中起重要作用。而检测Parkin蛋白量的表达显示，第I、II组比较，第I、III组比较，均P <0.05，第II、III组比较，P＜0.01，说明Parkin蛋白功能受损在散发型PD的发病机制中起部分作用，而“抗帕颗粒”干预同样可显著提高Parkin蛋白量，是治疗PD的机制之一。
minio结合“抗帕颗粒”现代药理分析，分析以上作用的原因，抑制氧化应激是重要环节：氧化应激时，UPS功能受损，蛋白酶体组分被直接氧化或其功能被氧化蛋白产物抑制，这都可以导致UPS对α-syn 的降
解通路受阻，细胞内α-syn异常聚集；同时，异常增加的α-syn聚集反过来又加重UPS的功能损害，从而形成恶性循环，影响细胞正常功能及代谢，引起细胞变性死亡[19]。
综上所述，本研究对照分析“抗帕颗粒”保护PD多巴胺神经元的的作用机制及具体靶点，提出“抗帕颗粒”通过抗氧化应激作用改善UPS功能、抑制α-syn异常聚集，但不能完全逆转PD病理改变，合并多巴制剂等中西医结合综合治疗是PD治疗的一个方向，期待在下一步的基础与临床实践中作进一步的研究。
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