•122«中国矣容整形外科杂占2021年2丿J第32卷笫2期Chin J Azh Plast Surg,Feb2021\ol.32M).2
•基础研究论著•桝皮素通过抑制Src磷酸化抑制成纤维细胞的生长
刘洋I陶凯2
【摘要】目的探讨榊皮素(quercetin,QE)对成纤维细胞生长的调节作用方法自2018年1月至2019年1月辽宁中更药大学附属第四医院外科分别使川不同浓度的QE和生理盐水(对照组)处理增生性瘢痕成纤维细胞通过MT「实验检测不同浓度的QE对成纤维细胞增殖的作用，应用Annexin V-PI染色法观察成纤维细胞的凋亡情况「通过Weslern blot检测QE对p-Sr<-和Src蛋口的调节作用构建沉默Sn-的成纤维细胞系.MTT实验检测QE对于沉默Src的成纤维细胞的增殖作用；Western blot检测QE对沉默Src的成纤维细胞中p-Src和Srr蛋门的调节作用结果与对照组相比.24h时10jjmiol/I., 2()円"<>1/1.和40|xmol/I.的QE对于细胞增殖的抑制率分别为(2&72±4.23)%、(39.69±4.09)%和(53.51±5.53)%;QE能够促进成纤维细胞的凋亡，抑制P-Sre的表达水平.沉默Sre后,QE对于成纤维细胞增殖能力的抑制作用消失结论QE能够通过抑制Sn•的磷酸化抑制成纤维细胞的生长
【关键词】蝌皮素；成纤维细胞；增殖；凋亡
Inhibition of fibroblasts growth by quercetin through inhibiting Src phosphorylation
LIL)YTA0K(d.(Department of Surgery,lu(i(ming LJniversity of Tr(ulition(il Chine Medicine Hospital Subsidiary Fourth, Shenyang110101,China)
Corresponding author:TA0Kai,Email:************************
[Abstract]Objective To explore the regulatoiy effect of quercetin(QE)on the growth of fibroblasts.Methods From Januan 2018to Januan2019.the hypertrophic scar fibroblasts were treated by different concentrations of QE normal saline(control group). The effec t of different concentrations of QE on the proliferation of fibroblasts Weis detected by M'FT assay.The apoptosis of fibroblasts was obrved hy“nn e x i n V-PI staining.The regulatory effect of QE on p—Src and Sre protein was detected by Vl rstern blot.To con s t m et the fibroblast cell line of silencing Src.The proliferation effect of QE on fibroblasts with silencing Sn1was detected by MTT.The regulatory
of QE on p-Src and Src protein in fibroblasts with silencing Src was detected by Western blot.Results Compared with the control group, the inliibilion rale of1()|xmol/L,20|xmol/L and40|xmol/L QE on cell proliferation al24h was(28.72±4.23)%,(39.69±4.09)%and (53.51±5.53)%,respectively.The ap(屮losiw of fibroblasts could be promott^d and the expression of p—Src fould be inhibited by QE.After Sre was silenced,the inhibition of QE on Gbroblasts proliferation was disappeared.Conclusion QE can inhibit the growth of fibroblasts by inhibiting Src phosphorylation.
瑜伽健身球
[Key words]Quercetin;Fibroblasts;Proliferation;Apoptosis
懈皮素(quercetin,QE)是一种存在于水果和蔬菜中的黄酮类化合物，作为一种补充剂具有良好的
安全性和生物利用度。QE具有抗炎和抗肿瘤活性，是一种抗氧化剂，可降低慢性疾病健康状况影响的风险，包括心血管和神经退行性疾病、糖尿病和肿瘤发生叭QE也被证明具有一定的抗纤维化能力叫有报道指出,QE能够通过抑制Sw信号通路调节多种细胞的生物学功能“。
Src活性受2个不同残基的酪氨酸磷酸化调控，具有相反的作用。Tyr529的磷酸化使Sre失活，而Tyr416的磷酸化导致Src活化。Src在巨噬细胞-
1)01:10.3969/j」s*n.1673-7040.2021.02.018
作者单位：1.辽宁中医药大学附属第四医院外科，辽宁沈阳110101:2.北部战区总医院烧伤整形科.辽丫沈阳110001recruits
通信作者：陶凯.Email:luzongzhengxing^-i 肌成纤维细胞转化，以及转化生长因子-B1诱导的骨髓源性巨噬细胞改变为成纤维细胞样形态、a-平滑肌肌动蛋门表达和胶原生成过程中发挥着重要作用叫研究表明,Src在培养的小鼠角膜上皮细胞损伤边缘的细胞中被激活，它整合了斑马鱼早期的创伤反应和后期的再生，提示Sre可能在创伤愈合的各个阶段发挥着重要作用铁也有报道证明Sre参与增生
性瘢痕的形成过程叫
自2018年1月至2019年I月辽宁中医药大学附属第四医院外科进行了一系列研究，本研究初步探讨了QE对成纤维细胞生物学功能的作用，并检测了QE对于Sre信号通路的调节作用，旨在寻找新的预防和治疗瘢痕的理论基础。
1材料
改良Eagle培养基(dulbecco's modified eagle
中国美容整形外科杂志2021年2月第32卷第2期Chin.1Aesth Plast Surg,Feb2021V（）L32No.2・123・
medium,DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；膜联蛋门V-碘化丙1®（A n nexin V-Propidium iodide,Annexin V-PI）、细胞裂解液、lipo2000脂质体（上海碧云天生物技术有限公司）; QE（美国Selleck生物科技有限公司）;3-（4,5-二甲基嗟哩-2）-2,5-二苯基四氮哩漠盐［3-（4,5—Dimethylthiazol—2—yl）—2,5—diphenyltetrazolium bromide,MTT］、二甲基亚砚（dimethylsulfoxide,DM-SO）（宝生物工程大连有限公司）;p-Src抗体（Src的9A6磷酸化位点抗体,sc-81521）,Src抗体（sc-130074）、GAPDH抗体仗-47724）、si_NC小链无意义对照小链、si-Src小链沉默Src小链（sc-270080,SANTA公司）。2方法
2.1细胞培养增生性瘢痕成纤维细胞为实验室冻存（上海冠导生物工程有限公司），使用含10%胎牛血清的DMEM培养细胞，细胞置于37T5%0（）2的孵箱中进行培养。
2.2MTT实验选取对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞，以1x10'/孔的密度接种于96孔板中，细胞贴壁后使用生理盐水（对照组）、10、20、40pmol/L 的QE处理成纤维细胞032,24,36和48h后在每孔中加入5mg/ml的MTT,37七孵箱中孵育4h。去上清液，加入100jil DMSO溶解形成的MTT-甲臘结晶,490nm处检测吸光值。
2.3细胞凋亡检测使用生理盐水（对照组）、10|imol/L、20ixmol/L和l/L的QE处理成纤维细胞24h，胰蛋口酶消化制成单细胞悬液。使用10|il AnnexinV-PI对细胞进行避光染色15min，流式细胞仪分析。
2.4Western hint实验使用生理盐水、20和l/L QE、si-NC、si—Src、si—NC+l/L QE、si-Src+ 20jjimol/L QE处理细胞24h后，裂解液裂解细胞，检测蛋白浓度。分别取30 pg蛋白进行SDS-PAGE 电泳，转印至PVDF膜后，使用质量分数5%的脱脂奶粉室温封闭I h o一抗（p_Src,Src和GAPDH, 1:1000）4七条件下孵育过夜。洗膜，加入二抗（山羊抗小鼠，1：5000）室温孵育1h c.采用ECL发光法检测蛋白的表达情况。
2.5转染细胞贴壁后，使用li P o2000脂质体进行转染，分别将不同小链（si-NC和si-Src）lipo2000脂
质体混合，加入培养基中。
2.6统计学处理使用SPSS12.0软件进行统计学分析。统计数据以x±s表示，应用方差分析进行组间差异比较，以/><0.05为差异有统计学意义。3结果
3.1QE对成纤维细胞生长的作用使用10、20和40pumol/L的QE处理成纤维细胞0、12、24、36和48h。结果发现.QE可以显著抑制细胞的增殖能力，其中，作用24h时10、20和40fi mol/L的QE对于细胞增殖的抑制率分别为（28.72±
4.23）%、（39.69±4.09）%和（53.51±
5.53）%。见图1。
图1QE对成纤维细胞的増殖情况（”=3.*与对照组相比./><0.05）使用10、20和40|X mol/L的QE处理成纤维细胞24h后，凋亡检测结果显示,QE处理的成纤维细胞凋亡比例增加.与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
3.2QE对p-Sre的影响Western blot结果显示，QE作用24h后，成纤维细胞中p-Sre的表达下调. Src的表达几乎不变，见图3。
3.3QE通过抑制p-Src影响成纤维细胞的增殖分别在成纤维细胞中转染si-NC和si-Sre，转染24h 后，使用20ixmol/1.的QE处理细胞,MTT实验检测结果发现，与si-NC组相比转染si-Src后，细胞的增殖受到抑制，QE能够显著下调转染si-NC组的细胞的增殖情况，但是对于转染si-Src细胞儿乎无作用。见图4。
通Western blot结果发现，与对照组与si-NC相比,Src蛋白和p-Sn，蛋白的表达显著下调；对照组与si-NC相比,QE的添加能够显著下调p-Src的表达,si-NC+20|jLmol/L与si-Src+20pimol/L相比,QE 对于p-Sre的作用儿乎消失。见图5。
4讨论
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是由于伤口愈合反应异常引起的，包括细胞外基质的过度增生和长期沉积，其主要特征是真皮成纤维细胞过度增殖和活化，以及胶原和细胞外基质代谢紊乱叫改进增生性瘢痕和瘢痕疙瘩治疗需要更深入地了解导致增生性瘢痕和瘢痕疙瘩发生的分子机制，以及筛选新的治疗方法
。
・124・
屮国美容整形外科杂志 2021 年 2 丿］第 32 卷第 2 期 Chin J Aesth Plasi Surg. 1-.-1) 2021 \ol. 32 No. 2
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图2 QE 对成纤维细胞凋亡的影响（*与对照组相比,PV0.05）图3 QE 对Src 和p-Src 的影响a. Western blot 检测蛋白表达情况h.
Western Mot 结果统计分析（*与对照组相比,P<0.05）图4 QE 处理后成纤维细胞的增殖情况（“=3,*与4NC 相比,P<0.05）图5 QE 处
理后蛋门的表达情况a. Western blot 检测蛋白表达情况I ）. Western blm 结果统计分析（*与si-NC 相比,P<0.05;#与si-Src 相比,P<0.05 ）
研究表明，QE 作用后HepG2细胞中p53水平 增加，细胞周期素A 和检查点激酶1表达减少，药
物可以通过对这些蛋门的调节作用发挥抑制细胞
增殖的作用叫在另一项研究中观察到.QE 能够通 过上调pl6、p21和P 53促进细胞在G0/G1期发生 阻滞比 细胞凋亡也是QE 诱导细胞死亡的机制之 一，其表现为促进凋亡蛋白Bax 的表达增加和促进
caspas-3和caspas-9的裂解性在抗纤维化作用
中，QE 包埋于乙型肝炎核心蛋门纳米笼中，可以 用于肝纤维化的成像和靶向治疗切。QE 能够通过
ROS 调节MAPK 信号通路抑制心肌纤维化㈣。QE
能够通过诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和抑制
PI3K/AKT/mT0R 途径抑制瘢痕细胞的生长叩。体外
伤I I 模型显示,QE 治疗后，可以介导细胞外基质减 少.从而促进纤维化的减少
在本研究中发现.QE 能够显著抑制成纤维细 胞的增殖能力，作用24 h 时10、20和40 |xmol/L 的
QE 对于细胞增殖的抑制率分别为（28.72 + 4.23）%、（39.69 ±4.09）%和（53.51 ± 5.53）%。并且
QE 处理成纤维细胞24 h 后也能够诱导细胞凋亡的
发生QE 对于成纤维细胞增殖能力的抑制作用和 凋亡能力的促进作用.可以减少增生性瘢痕以及瘢
痕疙瘩中成纤维细胞的过度生长.
随着分子生物学的发展，越来越多的物质被发
现并鉴定成为通过靶标S.V 来发挥治疗疾病的作 用一 Sre 参与了细胞增殖、迁移、黏附以及肿瘤发生 等多种细胞信号事件：Src 抑制剂可以抑制TGF-pl
诱导的真皮成纤维细胞增殖和迁移，抑制a-SMA 的增强表达和FAK 的活化"I 此外.抑制成纤维细
胞和巨噬细胞的活化.可进一步抑制瘢痕的形成
QE 被证明可以通过降低Sre/Stal3/S100A7信号抑
制鳞癌的迁移和侵袭，也町以通过对NF-k B 信号通
路中Sr<-的抑制作用发挥其抗炎作用问。本研究发 现,QE 能够显著抑制S"的表达，但是对于Src 的 表达几乎无作用。为了印证QE 对于成纤维细胞增 殖的抑制作用是否通过抑制Sre 实现的.我们构建
了沉默S.V 的细胞系。M'门' 实验结果显示，沉默Sre 能够显著抑制成纤维细胞的增殖作用.QE 对于沉
默后Src 的细胞增殖几乎无抑制作用。Western blot
结果也证明.沉默Sre 后QE 的作用几乎消失。
综上所述,QE 能够通过抑制Src 的磷酸化抑制
成纤维细胞的生长作用，QE 可考虑用于增生性瘢 痕和瘢痕疙瘩的预防和临床治疗
（下转后插2-5页
）
中国美容整形外科杂志2021年2J第32卷第2期Chin J Aeslh Plast Surg.Feb2021Vol.32No,2后插2-5 (上接121页)
死后小鼠所提取的ADSCs进行活性及分化能力的对比，需要在今后的研究中加以验证。
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(收稿日期:2020-11-15)
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(收稿日期：2020-10-25)
