第47卷第6期2021年11月吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.47No.6
Nov.2021
DOI：10.13481/j.1671‑587X.20210614
瑞德西韦对感染肠道病毒71型的人横纹肌瘤细胞和
ICR乳鼠的抗病毒活性
任晓风1，闫赟政2，李微2，李月香2，肖军海2，曹瑞源2，李永刚1（1.锦州医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁锦州121000；2.军事科学院军事医学研究院
毒物药物研究所，北京100850）
［摘要］目的
目的：探讨瑞德西韦（RDV）在细胞与动物水平对肠道病毒71型（EV71）的抗病毒活性，并阐明其抗病毒作用机制。方法生活大爆炸 美剧
方法：基于人横纹肌瘤（RD）细胞进行RDV抗肠道病毒活性评价，检测RDV对EV71、柯萨奇病毒A6型（CA6）、肠道病毒D68型（EVD68）和柯萨奇病毒16型（CA16）的半数毒性浓度（CC50）和半数有效浓度（EC50），计算选择指数（SI）。将RD细胞分为细胞对照组（不处理）、病毒对照组和给药组。病毒对照组RD细胞给予EV71病毒液，给药组RD细胞再给予不同浓度（0.005、0.015、0.046、0.137、0.410、1.230、3.700、11.110、33.330和100.000µmol·L－1）RDV。72h后，采用CellTiter-Glo®Luminescent检测试剂盒测定各组RD细胞活性。在抗EV71细胞活性评价实验中，将RD细胞分为给药组和病毒对照组，给药组RD细胞给予不同浓度（0.03、0.10、0.30、0.80和2.50µmol·L－1）RDV。30h后，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组RD细胞中EV71RNA表达水平，采用Western blotting法和免疫荧光法检测各组RD细胞中EV71结构蛋白VP1表达量。采用加药时序实验验证RDV的抗病毒作用阶段。在抗EV71动物药效学实验中，将35只ICR乳鼠随机分为安慰剂组（给予2%Tween80，n=12）、3.0mg·kg－1RDV组（给予3.0mg·kg－1RDV，n=12）和1.5mg·kg－1组RDV组（给予1.5mg·kg－1RDV，n=11），每只乳鼠经腹腔攻毒5×103PFU。4h后进行第1次给药，连续给药2周，观察并记录乳鼠生存率。在攻毒后第3天采用RT-qPCR法检测各组乳鼠各种组织中病毒载量（即EV71RNA拷贝数）。结果
机电维修结果：RDV对EV71、CA6、EVD68和CA16的EC50分别为（0.05±0.01）、（0.14±0.06）、（0.02±0.01）和（0.10±0.03）µmol·L－1。与病毒对照组比较，0.10、0.30、0.80和2.50µmol·L－1RDV组RD 细胞中EV71RNA表达水平降低（P<0.05或P<0.01），0.80和2.50µmol·L－1RDV组RD 细胞中EV71结构蛋白VP1表达量降低。与病毒对照组比较，0.80µmol·L－1RDV组RD细胞中Ⅲ和Ⅳ阶段（病毒复制阶段）时EV71病毒基因组RNA拷贝数明显降低（P<0.05）。与安慰剂组比较，各给药组乳鼠生存率差异无统计学意义（P>0.05），但有一定的保护趋势。与安慰剂组比较，
3.0mg·kg－1RDV组乳鼠肺和肌肉组织中病毒载量明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论
结论：RDV对以EV71为代表的肠道病毒具有良好的细胞水平抗病毒活性，并主要作用于病毒感染后的复制阶段。
RDV能明显降低小鼠肺和肌肉组织中病毒载量，提示其在动物水平有一定的治疗潜力。
［关键词］瑞德西韦；肠道病毒71型；人横纹肌瘤细胞；ICR乳鼠
［中图分类号］R512.5［文献标志码］A
[文章编号]1671‑587X(2021)06‑1446‑09
[收稿日期]2021‑04‑07
[基金项目]辽宁省教育厅基础研究项目（JYTJCZR201909）
triplet
[作者简介]任晓风（1993－），女，河北省邯郸市人，在读硕士研究生，主要从事抗病毒药物方面的研究。
[通信作者]李永刚，教授，硕士研究生导师（E-mail：*****************）；
曹瑞源，副研究员（E-mail：************）
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1447任晓风，等.瑞德西韦对感染肠道病毒71型的人横纹肌瘤细胞和ICR乳鼠的抗病毒活性
Antiviral activity of remdesivir against human rhabdomyosarcoma cells and ICR suckling mice infected
with enterovirus71
REN Xiaofeng1,YAN Yunzheng2,LI Wei2,LI Yuexiang2,XIAO Junhai2,CAO Ruiyuan2,LI Yonggang1（1.Department of Pathogenic Biology，School of Basic Medical Sciences，Jinzhou Medical Univer
sity，Jinzhou121000，China；2.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical
Sciences，Academy of Military Sciences，Beijing100850，China）
ABSTRACT Objective：To explore the antiviral activity of remdesivir（RDV）against enterovirus71（EV71）in the cellular and animal levels，and to clarify its antiviral mechanism.Methods：The anti-enterovirus activity of RDV was evaluated bad on the human rhabdomyosarcoma（RD）cells.The half toxic concentration（CC50）and half effective concentration（EC50）of RDV for EV71，Coxackie virus6（CA6），enterovirus68（EVD68），and Coxackie virus16（CA16）were detected，and the lection index （SI）was calculated.The RD cells were divided into cell control group，virus control group（without treatment）and administration groups.The RD cells in virus control group were given EV71，and the RD cells in administration groups were given different concentrations（0.005，0.015，0.046，0.137，0.410，1.230，3.700，11.110，33.330，and100.000µmol·L－1）of RDV.After72h，CellTiter-Glo®Luminent assay kit was ud to determine the activities of RD cells in various groups.In the cell activity evaluation experiment of anti-EV71，the RD cells were divided into administration groups and virus control group.The RD cells in administration groups were given different concentrations（0.30，0.10，0.30，0.80and 2.50µmol·L
－1）of RDV.After30h，the expression levels of EV71RNA in the RD cells in various groups were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method，and the expression levels of EV71structural protein VP1in various groups were detected by Western blotting and immunofluorescence methods.Time of addition assay was ud to conform the antiviral stage of RDV.In anti-EV71animal pharmacodynamics，35ICR suckling mice were randomly divided into placebo group （given2%Tween80，n=12），3.0mg·kg－1RDV group（given3.0mg·kg－1RDV，n=12）and 1.5mg·kg－1RDV group（given1.5mg·kg－1RDV，n=11）；each suckling mou was challenged intraperitoneally with5×103PFU.The first do was given after4h，and the treatment lasted for2weeks. The survival rates of the sucking mice in various groups were obrved and recorded.On the3rd day after challenge，the viral loads（copy number of EV71RNA）in different tissues of the suckling mice in various groups were detected by RT-qPCR method.Results：The EC50of RDV for EV71，CA6，EVD68，and CA16were（0.05±0.01），（0.14±0.06），（0.02±0.01），and（0.10±0.03）µmol·L－1，respectively. Compared with virus control group，the expression levels of EV71RNA in the RD cells in0.10，0.30，0.80，and2.50µmol·L－1RDV groups were decread（P<0.05or P<0.01），and the expression levels of EV71structural protein VP1in the RD cells in0.80and2.50µmol·L－1RDV groups were decread. Compared with virus control group，the copy numbers of EV71RNA in the RD cells at stagesⅢandⅣ（virus replication st
age）were decread significantly（P<0.05）.There were no significant differences in the survival rates of the suckling mice between administration groups and placebo group（P>0.05），but there was a certain protective trend.Compared with placebo group，the viral loads in lung and muscle tissues of the suckling mice in3.0mg·kg－1RDV group were decread significantly（P<0.05or P< 0.01）.Conclusion：RDV has an excellent antiviral activity against enterovirus（such as EV71）at the cellular level，and mainly acts on the replication stage of viral infection.RDV can significantly reduce the
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吉林大学学报（医学版）
viral loads in lung and muscle tissues，suggesting its therapeutic potential at the animal level. KEYWORDS remdesivir；enterovirus71；human rhabdomyosarcoma cells；ICR suckling mou
肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒属，是一种无包膜的单股正链病毒［1］。EV71是手足口病的主要病原体之一，也被认为是继脊髓灰质炎病毒后最强的嗜神经性肠道病毒［2-3］。婴幼儿感染后，可导致脑干脑炎、无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹和神经源性肺水肿等多种神经系统疾病，严重者甚至死亡［4-5］。然而，目前针对所有的肠道病毒感染，临床尚无可用的
抗病毒药物，亟需研发新型抗肠道病毒药物。核苷类似物类药物能够靶向病毒编码的聚合酶，是抗病毒药物研发的重要方向之一。瑞德西韦（remdesivir，RDV，GS-5734）是腺苷类似物的前药，2016年有研究［6］显示：RDV能保护埃博拉病毒感染的恒河猴免于死亡，改善其症状，降低其病理损伤。在2014年西非埃博拉病毒疫情爆发期间，研究者［7］采用单克隆抗体和RDV对1例感染者进行治疗的结果显示：患者迅速康复，且未观察到与药物相关的不良反应。RDV能有效抑制多种冠状病毒［8-12］、副黏病毒［13-14］和黄病毒［15］等多种RNA病毒的复制，有望成为一种新型的广谱抗病毒药物。然而，RDV对肠道病毒的药效学研究尚未得到充分开展，尤其是其在动物水平的有效性尚未见报道。本研究首先构建基于人横纹肌瘤（rhabdomyosarcoma，RD）细胞的抗病毒活性评价模型，对RDV的广谱抗肠道病毒活性进行评价，并探讨其在RNA和蛋白水平对EV71的抑制效果，初步阐明其抗病毒作用的机制；其次，通过构建基于ICR乳鼠的感染模型，探讨RDV对小鼠生存保护和组织病毒载量变化的影响，为RDV用于治疗EV71感染提供依据。1材料与方法
lyrc1.1细胞
细胞、、病毒和实验动物人RD细胞购自美国模式培养物研究所（American Type Culture Collection，ATCC）。EV71（H株）、肠道病毒D68型（EVD68）株、柯萨奇病毒6型（CA6）（TW-2007-00141株）和柯萨奇病毒16型（CA16）（119株）由军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所保存。35只无特定病原体（SPF）1d龄ICR乳鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：S
CXK（京）2016-0006。
1.2主要试剂和仪器RDV购自上海科胜药物研发有限公司，NITD008（广谱的黄病毒［16］RdRp抑制剂）购自美国MedChemExpress公司，β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自北京伊诺凯科技有限公司，胎牛血清（fetal bovine rum，FBS）、DMEM 培养基、胰酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）和青霉素-链霉素购自美国Gibco公司，TRIzol和羊抗鼠IgG（H+L）Alexa Fluor TM Plus 二抗购自美国Invitrogen公司，RNeasy®Mini试剂盒购自德国Qiagen公司，One Step PrimeScript TM实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，EV71VP1一抗为厦门大学程通教授惠赠，Alpha Tubulin单克隆抗体购自美国Abcam公司，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CellTiter-Glo®Luminescent细胞活力检测试剂购自北京Promega 生物技术有限公司。多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司，RT-qPCR仪购自美国Applied biosystems公司，凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司，转盘共聚焦活细胞成像系统购自美国PerkinElmer公司，ADMET Predictor8.5软件购自上海凡默谷信息技术有限公司。
1.3细胞培养和动物饲养RD细胞采用含有10%FBS的DMEM培养基培养于细胞培养箱（37℃、5%CO2）中，每3d传代1次。1d龄ICR 乳鼠饲养于生物安全性小鼠饲养设施中。
1.4RDV细胞水平抗肠道病毒效率检测RD细胞以1×105mL－1的密度接种于96孔板，每孔
100µL，贴壁培养过夜；将其分为细胞对照组、病毒对照组和给药组。将含有不同浓度（0.005、0.015、0.046、0.137、0.410、1.230、3.700、11.110、33.330和100.000µmol·L－1）RDV的培养基加入给药组（即0.005、0.015、0.046、0.137、0.410、1.230、3.700、11.110、33.330和100.000µmol·L－1RDV组）；给药组与病毒对照组RD细胞中加入100半数组织培养感染剂量（median tissue culture infective do，TCID50）的EV71病毒液，72h后采用CellTiter-Glo®Luminescent检测试剂盒检测各组RD细胞活性。药asmbledinchina
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任晓风，等.瑞德西韦对感染肠道病毒71型的人横纹肌瘤细胞和ICR乳鼠的抗病毒活性
物细胞毒性实验：细胞接种密度同上，将其分为细胞对照组和给药组（不同浓度RDV组）。将上述含相同浓度RDV的培养基加入给药组，培养30和72h后，检测各组细胞活性。RDV抗EVD68、CA6和CA16活性评价方法同上。RDV抗病毒活性实验：给药组细胞存活率=（给药组活细胞数－病毒对照组活细胞数）/（细胞对照组活细胞数－病毒对照组活细胞数）×100%；药物毒性实验：给药组细胞存活率=给药组活细胞数/细胞对照组活细胞数×100%。以存活率代表细胞活性。采用Origin9.0软件拟合半数毒性浓度（50%cytotoxic concentration，CC50）和半数有效浓度（50% effective concentration，
EC50），计算选择指数（lection index，SI）。SI=CC50/EC50。popi
potential是什么意思1.5RT-qPCR法检测药物处理后细胞中病毒RNA的表达水平RD细胞以4×105mL－1的密度接种于12孔板，每孔1mL，贴壁培养过夜，感染复数（multiplicity of infection，MOI）=0.1，EV71病毒液感染细胞，给药组RD细胞中加入不同浓度（0.03、0.10、0.30、0.80和
2.50µmol·L－1）RDV，病毒对照组RD细胞中加入含2%FBS的DMEM培养基，在37℃共孵育，30h时采用RNeasy®Mini试剂盒收集细胞中RNA，RT-qPCR 法检测各组RD细胞中EV71RNA拷贝数。相关引物和探针序列：EV71-Forward primer，5'-CCAAT-CTCAGCGGCTTGGAG-3'，EV71-Rever primer，5'-CACTCAAGCTCTACCGG-CAC-3'，EV71-probe，5'6FAM-TCCAATCGAT-GGCTGCTCA-CCTGCGT-3'BHQ1。反应条件：42℃、25min，1个循环；95℃、3min，1个循环；95℃、20s，59℃、1min，PCR扩增，共40个循环。以EV71 RNA拷贝数代表EV71RNA表达水平。
1.6Western blotting法检测药物处理后各组细胞中EV71结构蛋白VP1表达量RD细胞以4×105mL－1的密度接种于12孔板，每孔1mL，贴壁培养过夜；MOI=0.1，EV71病毒液感染细胞，给药组RD细胞中加入不同浓度（0.03、0.10、0.30、0.80和
2.50µmol·L－1）RDV，病毒对照组RD细胞加入2%FBS的DMEM，24h后收集细胞并加入适量裂解液，充分裂解细胞，离心，收取上清。将上清与上样缓冲液混合均匀，80℃加热10min。将处理好的
样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用湿转转膜法将蛋白转移至PVDF膜上，5%BSA在室温封闭1h，加入相应稀释度的一抗，4℃过夜，TBST洗涤3次，加入相应HRP标记的二抗，室温孵育1.5h，TBST洗涤3次，加入Super ECL Plus超敏发光液进行化学发光显色。定性观察目的蛋白表达量。
1.7免疫荧光法检测药物处理后各组细胞中EV71结构蛋白VP1表达RD细胞以1×105mL－1的密度接种于96孔板，每孔100µL，贴壁培养过夜；MOI=0.1，EV71病毒液感染细胞，给药组加入不同浓度（0.03、0.10、0.30、0.80和
2.50µmol·L－1）RDV，病毒对照组加入含2%FBS的DMEM培养基，在37℃孵育30h后，采用4%甲醛固定30min，PBS洗涤；加入Hoechst33342细胞核染料，37℃孵育0.5h；采用0.1%Triton X-100透化，PBS洗涤；采用5%BSA于37℃孵育0.5h；加入相应稀释度的一抗，室温避光孵育2h，加入5%BSA洗涤。加入相应稀释度的Alexa Fluor TM Plus二抗，室温避光孵育1h，弃液，PBS洗涤，荧光显微镜观察下EV71结构蛋白VP1的表达。
1.8加药时序实验检测病毒感染不同阶段RD细胞中EV71RNA表达水平RD细胞以4×105mL－1的密度接种于12孔板，每孔1mL，贴壁培养过夜；按照加药时序实验策略进行加药，分为病毒对照组、0.08μmol·L－1RDV组和3.00μmol·L－1阳性对照药物NITD008组。30h时，采用RNeasy®Mini Kit收集细胞中RNA，RT-qPCR法检测细胞中EV71RNA拷贝数。以EV71RNA拷贝数代表EV71RNA表达水平。
cain1.9RT-qPCR法检测各组乳鼠各种组织中病毒载量将购买的35只SPF级1d龄ICR子母鼠随机分为3组，分别为安慰剂组（给予2%Tween80，n=12）、3.0mg·kg－1RDV组（n=12）和1.5mg·kg－1RDV组（n=11）。每组乳鼠经腹腔攻毒，每只5×103PFU，并于攻毒后4h，分别给予安慰剂和相应药物处理，之后每天给药1次，连续给药2周，观察21d，记录各组乳鼠的生存情况，绘制生存曲线。组织中病毒载量检测：于感染后3d处死乳鼠，取乳鼠脑、肺和肌肉组织匀浆，采用TRIzol法提取总RNA，RT-qPCR法检测各组织中EV71RNA拷贝数，以EV71RNA拷贝数代表相应组织中病毒载量。
1.10RDV血脑屏障渗透性检测将RDV化学结
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构信息录入ADMET Predictor8.5软件。选择pH=7的参数，运行生物药剂学性质模块，从定性和定量两方面预测该药血脑屏障渗透性。BBB-Filter是定性预测化合物血脑屏障渗透性的参数，Log BB是定量预测化合物血脑屏障渗透性的参数。当BBB-Filter预测结果为High，表示化合物容易透过血脑屏障；Low表示化合物不易透过血脑屏障。当Log BB预测结果大于－1时，表示化合物的血脑屏障渗透性较高；反之，表示化合物的血脑屏障渗透性较低。
1.11统计学分析采用GraphPad Prism8.0.2统计软件绘制RDV对EV71、EVD68、CA6和CA16的抗病毒作用和细胞毒性作用的曲线模式图。采用GraphPad Prism8.0.2统计软件进行统计学分析。各组细胞中EV71RNA拷贝数符合正态分布，以x±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。各组乳鼠生存率以百分率表示，组间生存率比较采用Log-rank检验。各组小鼠脑、肺、肌肉组织中病毒载量均符合正分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
japane big2.1在安全浓度范围RDV对EV71、CA6、EVD68和CA16的EC50、CC50及SI CellTiter-Glo®Luminescent细胞活性检测试剂检测结果显示：RDV在无毒浓度范围内，能有效抑制EV71、CA6、EVD68和CA16的复制。RDV对EV71的EC50为（0.05±0.01）µmol·L－1、CC50为（2.54±0.06）µmol·L－1、SI为50.80；RDV对CA6的EC50为（0.14±0.06）µmol·L－1、CC50为（1.78±0.30）µmol·L－1、SI为12.71；RDV对EVD68的EC50为（0.02±0.01）µmol·L－1、CC50为（1.12±0.02）µmol·L－1、SI为56.00；RDV对CA16的EC50为（0.10±0.03）µmol·L－1、CC50为（1.89±0.48）µmol·L－1、SI为18.90。见图1。2.2各组RD细胞毒性和RD细胞中EV71RNA表达水平在实验浓度范围内，各浓度RDV处理细胞后细胞活性比较差异无统计学意义（P>0.05），即各组细胞毒性比较差异无统计学意义（P> 0.05）。将RDV作用于EV71感染的RD细胞，30h 时收集样品，采用
RT-qPCR法检测细胞中EV71 RNA表达水平结果显示：与病毒对照组比较，加药组（0.10、0.30、0.80和2.50µmol·L－1RDV组）RD细胞中EV71RNA表达水平降低（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖关系，0.03µmol·L－1RDV 组RD细胞中EV71RNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
2.3各组RD细胞中EV71结构蛋白VP1表达量
与病毒对照组比较，给药组（0.10、0.30、0.80和2.50µmol·L－1RDV组）RD细胞中EV71结构蛋白VP1表达水平降低。见图3。免疫荧光检测结果显示：与病毒对照组比较，0.80和2.50µmol·L－1RDV组RD细胞中EV71结构蛋白VP1表达量降低。见图4。
2.4各组EV71病毒RNA拷贝数采用加药时序实验在病毒感染的不同阶段加入药物。加药时序实验的检测结果显示：与病毒对照组比较，0.80µmol·L－1RDV组在Ⅲ和Ⅳ阶段（病毒复制阶段）RD细胞中EV71RNA拷贝数明显降低（P< 0.05）。与病毒对照组比较，
3.00µmol·L－1阳性对照药物NITD008组在Ⅲ和Ⅳ阶段RD细胞中EV71 RNA拷贝数明显降低（P<0.05）。与病毒对照组比较，RDV和阳性对照药物NITD008组在Ⅰ和Ⅱ阶段RD细胞中EV71RNA拷贝数差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。
2.5各组乳鼠生存率和不同组织中病毒载量采用每日给药1次的方式，连续给药14d，观察21d。与安慰剂组比较，1.5和
3.0mg·kg－1RDV组乳鼠生存率有一定程度升高，但各组乳鼠生存率比较差异无统计学意义（P>0.05）。安慰剂组、1.5和3.0mg·kg－1RDV组乳鼠生存率分别为33%、55%及75%；与安慰剂组比较，1.5和3.0mg·kg－1RDV 组乳鼠生存率分别提高了22%及42%；与1.5mg·kg－1RDV组比较，3.0mg·kg－1RDV组小鼠生存率增加了20%。见图6。
为了进一步探讨生存保护不理想的原因，对不同组织中病毒载量进行分析。于病毒感染后第3天处死小鼠，采集新鲜组织样本，并检测脑、肺和肌肉组织中病毒载量。与安慰剂组比较，3.0mg·kg－1RDV组乳鼠肺和肌肉组织中EV71 RNA拷贝数降低，即病毒载量明显降低（P<0.05或P<0.01），而脑组织中病毒载量差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。
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2.6RDV血脑屏障渗透性ADMET Predictor 8.5软件预测结果显示：定性预测结果为Low
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