巴拉圭地区传统发酵乳制品中乳酸菌的分离鉴定
苏 馨，袁 婧，柳 青，郭 琳，刘文俊*
（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，
内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）
摘 要：为获得更加丰富的乳酸菌资源，系统研究巴拉圭地区传统乳制品中乳酸菌的生物多样性，采用传统纯培养方法结合16S rRNA 基因序列分析技术和系统发育进化关系分析技术对巴拉圭地区传统乳制品中乳酸菌进行分离纯化和种属鉴定。结果表明，来自巴拉圭地区的8 份传统乳制品中共分离得到79 株乳酸菌，分属于4 个属、7 个种，其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）为巴拉圭地区传统发酵乳中的优势菌种，占总分离菌株的68.35%。关键词：巴拉圭；传统发酵乳；乳酸菌；16S rRNA ；纯培养；系统发育进化关系
Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Traditional Paraguayan Fermented Milk
SU Xin, YUAN Jing, LIU Qing, GUO Lin, LIU Wenjun *
(Inner Mongolia Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Key Laboratory of Dairy Prod
ucts Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education,
Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)Abstract: In order to enrich the resource of lactic acid bacteria and to systematically clarify the diversity of lactic acid bacteria in traditional Paraguayan fermented dairy products, lactic acid bacterial strains were isolated, purified and identified from traditional Paraguayan fermented milk by combined u of the traditional pure culture method, 16S rRNA gene quencing and phylogenetic analysis. A total of 79 strains were isolated from eight samples, which were identified to belong to ven species of four genera. Lactococcus lactis was found to be the dominant strain, accounting for 68.35% of the total isolates.
Keywords: Paraguay ; traditional fermented milk ; lactic acid bacteria ; 16S rRNA; pure culture; phylogenetic relationship DOI:10.15922/jki.jdst.2020.06.001
中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2020）06-0001-06
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引文格式：
苏馨, 刘文俊, 袁婧, 等. 巴拉圭地区传统发酵乳制品中乳酸菌的分离鉴定[J]. 乳业科学与技术, 2020, 43(6): 1-6. DOI:10.15922/jki.jdst.2020.06.001. rykj.cbptki
SU Xin, LIU Wenjun, YUAN Jing, et al. Isolation and identification of lactic acid bacteria from traditional Paraguayan fermented milk[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2020, 43(6): 1-6. DOI:10.15922/jki.jdst.2020.06.001. rykj.cbptki
收稿日期：2020-08-15
第一作者简介：苏馨（1995—）（ORCID: 0000-0002-0853-5013），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。
E-mail:***************
*通信作者简介：刘文俊（1978—）（ORCID: 0000-0002-2773-8043），男，副研究员，博士，研究方向为食品安全。
E-mail:****************
巴拉圭共和国支柱性产业为畜牧业，占全国GDP 的7.9%，其中乳制品行业的贡献率为23.3%[1]。巴
拉圭居民一直都有食用自制乳制品的习惯，鲜乳、奶酪、发酵乳等不同制作工艺的传统乳制品均深受当地居民的喜爱，是巴拉圭人民饮食和生活中不可或缺的一部分。巴拉圭地区独特的地理环境、气候因素及饮食习惯造就了该地区传统乳制品中微生物菌群结构的独特性和多样性。因
此对该地区传统乳制品进行生物多样性研究对于扩充乳酸菌资源、阐明当地乳酸菌菌群结构具有重要理论意义和研究价值。
近年来的一些研究发现，从自然乳制品中分离的乳酸菌具有重要的生产特性和应用价值，如产酸特性、抑菌特性等，这些来源于自然发酵食品中的有益菌可以抑制致病菌的生长[2-3]。当这些微生物处于传统乳制品环境
中时，不仅赋予其特殊的口感、独特的风味和质地等感官品质，乳制品益生特性也有所提高[4]，具有提高机体免疫功能、降低血清胆固醇含量、调节炎症反应及延缓衰老等功效[5-6]。因此，了解巴拉圭传统乳制品的乳酸菌多样性对于传统乳制品的品质改良和我国乳酸菌资源库的建设具有重要意义。
虽然乳酸菌的分类鉴定技术日新月异，但是16S rRNA基因序列分析技术在微生物分类学中仍然占据主导地位，是细菌鉴定的金标准，具有高效、快速和高通量等优势。本研究团队长期以来致力于保护和发掘我国传统发酵乳中乳酸菌资源的研究，从这些发酵乳中分离鉴定并保藏了大量乳酸菌。例如，从我国云南乳扇中分离得乳酸菌主要以瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和嗜热链球菌（Streptoc
occus thermophilus）为主[7]，从内蒙古地区采集的3 份绵羊奶油中分离得44 株乳酸菌，其中乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）为优势菌群[8]，从甘肃省和四川省6 个县27 个地区的不同牧民家庭采集牦牛乳及传统发酵牦牛乳制品，共分离得533 株乳酸菌，包括6 个属、24 个不同的种和亚种，其中乳杆菌属（Lactobacillus）246 株，占分离乳酸菌总数的46.15%，为样品的优势菌群[9]，从新疆、青海和内蒙古的游牧家庭采集酸马乳样品，共分离得171 株乳酸菌，其中瑞士乳杆菌为优势菌群[10]。近年来也正努力从世界各地采集传统发酵食品和乳制品，分离、保藏乳酸菌，为丰富我国乳酸菌资源作出贡献。孟和毕力格等[11]研究蒙古国和中国内蒙古地区酸马乳中乳酸菌的多样性，结果显示，采集自蒙古国的样品中乳酸菌菌种组成比较单一，主要以干酪乳杆菌（Lactobacillus cai）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）为主，而内蒙古地区样品中的乳杆菌种类较丰富，分离得到11 株乳酸菌及未确定的2 株乳杆菌属菌株。
本研究采用纯培养方法结合16S rRNA基因分析技术对巴拉圭地区传统乳制品中乳酸菌的生物多样性进行研究，不仅能够了解该地区多年流传下来的传统乳制品中乳酸菌菌群结构，并且在丰富我国乳酸菌菌种资源库的同时为筛选一些特异性功能较好的乳酸菌提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
8 份传统发酵乳样品由本实验室研究人员采集自巴拉圭的亚松森市和东方市，如表1所示。
表 1 巴拉圭地区传统乳制品分离源及计数结果
Table 1 Geographical sources and viable lactic acid bacterial counts of traditional Paraguayan yogurt samples
样品编号采集地乳酸菌活菌数/（CFU/mL）
BLG1亚松森市 1.5×107
BLG2亚松森市 1.6×106
BLG3亚松森市 1.0×107
BLG4亚松森市 1.9×108
BLG5东方市 3.2×106
BLG6东方市 2.3×108
BLG7东方市 2.4×106
BLG8东方市 1.3×107
MRS液体培养基、MRS固体培养基英国马尔文有限公司；琼脂上海雅培生物科技有限公司；蛋白酶K、Taq DNA聚合酶北京全式金生物技术有限公司；聚合酶链式反应（polymera chain reaction，PCR）试剂宝生物工程（大连）有限公司；TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；5×TBE电泳缓冲液天津基准化学试剂公司。
1.2仪器与设备
5810R台式高速冷冻离心机德国艾本德股份有限公司；CDS8000 UPV凝胶成像分析系统北京赛智创业科技有限公司；DYY-12电泳仪北京六一仪器厂；ND-1000微量紫外分光光度计北京众力挽生物科技有限公司；AB/Life梯度PCR仪济南天昌科技有限公司；Pacifico SMRT RS II测序平台美国柏诚公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集及计数scopolamine
样品采集后，吸取2 mL至加有灭菌中和剂（淀粉、CaCO3质量比50∶1）的无菌采样瓶中，并记录采集时的温度和pH值。密封及编号后放入干冰中保持低温，2～3 d运回实验室等待分离纯化。
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利用平板倾注法对样品进行乳酸菌活菌计数。将500 μL发酵乳加入到4.5 mL无菌生理盐水中进行梯度稀释，选择合适稀释度（105、106、107）与熔融的无菌MRS琼脂培养基混合，37 ℃恒温条件下培养24～48 h，记录菌落总数。
1.3.2乳酸菌的分离纯化及保存
将发酵乳样品恢复至室温后充分混匀，对8 份样品
进行稀释涂布培养[12]，37 ℃恒温条件下培养24～48 h，
培养完成后观察记录不同的菌落形态并编号，一般按照
颜色、形状、大小和边缘等形态进行区分。挑取菌落形
态不同的单个菌落进行划线纯化，选取革兰氏染色阳性
且过氧化氢阴性的纯培养物，进行挑菌传代培养。一般
情况下传至第3代菌种的活力最好，因此传至第3代，将
第2代的菌泥留作菌种鉴定备用。将处于对数期的第3代
菌株通过高速离心（4 000 r/min、5 min）收集菌泥，菌
泥用无菌磷酸缓冲盐（phosphate buffer saline，PBS）溶液洗涤2～3 次，倒掉上清液，保留纯培养物，每管混入800 μL 10 g/100 mL脱脂乳保护剂（脱脂乳、酵母粉质量比4∶1），将其充分振荡混匀之后，分装至无菌冻存管和安瓿管中，平均每管20 μL。用液氮急冻后置于－80 ℃冰箱内保存备用。
1.3.3 菌株基因组DNA的提取
将前期制备的2代菌株进行高速离心（4 000 r/min、5 min），并用无菌PBS洗涤2～3 次，收集纯培养物于1.5 mL无菌EP管中，采用TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA[13-14]。用微量紫外分光光度计检测DNA纯度，DNA纯度根据OD260 nm/OD280 nm比值判断，符合要求的纯化DNA OD260 nm/OD280 nm为1.6～1.8，低于此范围表明有蛋白质和酚类物质等污染，高于此范围表明样品中含有RNA。用琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取液质量。
1.3.4 样品乳酸菌分离株16S rRNA基因的PCR扩增
alleluia
D N A扩增采用的引物为：27F （5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’），1492R （5’-ACCTTGTTACGACTT-3’）。
PCR扩增使用50 μL体系：正、反向引物各1.5 μL、模板DNA 2 μL、10×PCR Buffer（含Mg2＋离子）
5 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 35.5 μL。
扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 个循环，72 ℃末端延伸10 min。
扩增完毕后，用琼脂糖凝胶电泳仪进行检测。在低温（－20 ℃）条件下送往上海美吉生物医药科技有限公司进行纯化和双向测序。
1.3.5 同源性分析
运用Dnaman软件对测序得到的2 条16S rRNA基因序列进行整合，通过对齐、拼接、校准等过程将其整合成1 450 bp左右的有效序列，再将其与数据库中已鉴定的乳酸菌16S rRNA基因序列进行同源性比对，确定与待鉴定菌株同源性最高的模式菌株，利用LPSN网站（ www.bacterio/）下载模式株序列。最后使用MEGA软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌分离纯化结果
经稀释涂布培养48 h后，初步从8 份传统发酵乳制品中分离得到乳酸菌疑似菌株79 株。由图1A可知，
菌株在固体培养基上的形态多为圆片状或雪花状，中央凸起，边缘部分较光滑，部分较粗糙。经分离纯化后，进行革兰氏染色检验，由图1B可知，所有染色结果均呈阳性，符合乳酸菌特征。根据形态特征差异，本研究初步将79 株菌株鉴定为乳酸菌，并对其作进一步鉴定。
A B
图 1 分离菌株在培养基上的形态（A）及革兰氏染色荧光显微镜图（B）Fig. 1 Colonies (A) and Gram staining examination (B) of lactic acid bacterial isolates cultured on MRS agar plates
2.2 菌种DNA提取和PCR扩增
M
2 000 bp
1 500 bp
750 bp
500 bp
250 bp
123456789101112131415161718192021222324
图 2 随机抽取部分分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增产物
琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 Agaro gel electrophoresis of PCR amplified 16S rRNA genes
from randomly lected isolates
符合浓度要求的DNA提取液经过PCR扩增之后，用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。由图2可知，可观察到一条明亮、清晰的条带，位置大约在1 500 bp处，并且无拖尾、弥散现象，表明PCR扩增产物扩增成功，满足测序要求。
2.3 乳酸菌鉴定结果
表 2 巴拉圭地区传统发酵乳中乳酸菌分离及鉴定结果
Table 2 Statistics of lactic acid bacteria isolated and identified from traditional fermented milk collecte
d from different Paraguayan cities
乳酸菌
分离菌株数量
亚松森市东方市总计斜肠球菌（Enterococcus italicus）11
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）28*26*54*
格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）123
柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）11肠膜明串珠菌（Leuconostoc menteroides）9312
假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pudomenteroides）246解没食子酸链球菌（Streptococcus gallolyticus）22
总计423779注：*. 该地区的优势菌种。表3同。
将分析处理后的16S rRNA基因序列与数据库中已有的乳酸菌16S rRNA序列进行同源性比对，由表2可知，8 份样品中共分离出79 株菌，包括54 株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、12 株肠膜明串珠
菌（Leuconostoc menteroides）、6 株假肠膜明串珠菌（Leuconostoc
pudomenteroides ）、3 株格氏乳球菌（Lactococcus garvieae ）、2 株解没食子酸链球菌（Streptococcus gallolyticus ）、1 株斜肠球菌（Enterococcus italicus ）和1 株柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum ）。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）的分离率达到68.35%，因此被认定为巴拉圭地区传统发酵乳制品中乳酸菌的优势菌群。2.4 系统发育关系分析
reliable的意思使用软件Bootstrap test of phylogeny 和Neighbor-Joining 对与模式菌株16S rRNA 序列同源性高于98%的菌株构建发育树，以映射分离菌株之间的关系，部分代表性菌株与模式菌株系统发育关系如图3所示。
IMAU96034IMAU96047
Lactococcus garvieae ATCC43921T ˄EU091459˅IMAU96077
Lactococcus lactis ATCC19435T
搞笑的英文名˄EU091395˅
IMAU96031
Streptococcus gallolyticus JCM10005T
˄X94337˅Enterococcus italicus DSM 15952T ˄AJ582753˅IMAU96074
IMAU96058
Leuconostoc citreum ATCC49370T ˄AF111948˅
IMAU96005
Leuconostoc menteroides ATCC8393T ˄CP000414˅IMAU96035
Leuconostoc pudomenteroides ATCC12291T
˄AB023237˅
IMAU96017IMAU96071
1001008110010061100
99100
99
701000.02图 3 巴拉圭地区传统发酵乳中代表性乳酸菌分离株16S rRNA
基因序列的系统发育树
Fig. 3
Phylogenetic tree constructed bad on 16S rRNA gene
quences for reprentative lactic acid bacterial isolates from traditional
Paraguayan yogurt
本研究将79 株分离菌株鉴定为乳酸菌的4 个属、7 个种。由图3可知，16S r R N A 基因序列与标准菌株序列同源性为100%的菌株有乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）IMAU96077、解没食子酸链球菌 （Streptococcus gallolyticus ）IMAU96031、斜肠球菌（Enterococcus italicus ）IMAU96074、柠檬明串珠菌（Leuconostoccitreum ）IMAU96058和假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pudomenteroides ）I M A U 96017、I M A U 96071。菌株格氏乳球菌（Lactococcus garvieae ）IMAU96034、IMAU96047和肠膜明串珠菌（Leuconostoc menteroides ）IMAU96035、IMAU96
005的16S rRNA 基因序列与标准菌株序列的 同源性均＞99%。79 株菌均为已鉴定菌株，未发现未鉴定新种。
2.5 优势菌群分析
采集自巴拉圭地区亚松森市和东方市地区的8 份发酵乳样品中共分离得到79 株乳酸菌，其中乳酸乳球菌
（Lactococcus lactis ）54 株，占分离菌株总数的68.35%，因此认定为巴拉圭传统乳制品的优势菌群，并且亚松森市和东方市的优势菌群也均为乳酸乳球菌。近年来研究表明，乳酸乳球菌在发酵乳制品和鲜乳中均有较高的分离率。赵飞燕[15]在对鲜马乳的研究中发现，乳酸乳球菌是鲜马乳中乳酸菌的优势菌群。作为乳酸菌属中最大的菌属，乳酸乳球菌对发酵制品的风味有重要影响，不仅如此，乳酸乳球菌还被认为是一类具有极高益生功能的菌株，付永岩等[16]对菌株的降胆固醇能力进行研究发现，乳酸乳球菌L14-3是其研究中降胆固醇能力最强的菌株。吴诗敏等[17]从鲜牛乳中分离出对李斯特菌具有良好益生效果的乳酸乳球菌。因此，可以认为乳酸乳球菌在人类的生产生活中发挥着重要作用。此外，在样品BLG3和BLG4中，肠膜明串珠菌的分离率分别为36.36%和30%，是2 个样品中乳酸菌的优势菌株之一。对内蒙古和甘肃酸马乳中乳酸菌多样性的研究结果也显示，肠膜明串珠菌均为酸马乳的优势菌群[18-19]。肠膜明串珠菌被我国卫生部与美国食品药品监督管理局列为安全可食用菌种
之一[20]，在泡菜发酵过程中，能够促进甘露醇等风味物质的形成，并且能够发酵甘蔗汁产生葡聚糖，促进肠道有益微生物生长[21]。因此，肠膜明串珠菌也被认为是一种极具开发潜力的微生物资源[22]。本研究发现，巴拉圭地区传统发酵乳制品中乳酸菌菌群结构丰富，含有多种人类生产生活必需的乳酸菌菌种，并且具有极高的益生特性。
2.6 南美洲地区乳制品中乳酸菌菌群分析
南美洲地区主要以农牧产品加工业为主，牛乳及乳制品种类繁多，并且拥有独特的乳酸菌菌群结构[23]。大量资料显示，巴拉圭周边地区乳制品中均存在丰富的优质乳酸菌源。
Luiz 等[24]对巴西原料乳中的乳酸菌进行分离鉴定，发现葡萄球菌属（Staphylococcus ）和乳酸乳球菌为该地区原料乳中优势菌群，并且原料乳中乳酸菌的菌群结构较单一。Silva 等[25]利用16S rRNA 基因序列分析方法对巴西水牛奶酪中的乳酸菌进行分类鉴定，分离得到的乳酸菌包括保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus ）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum ）和肠膜明串珠菌等共8 个种。Roxana 等[26]采集来自阿根廷西北部省份的4 份新鲜生乳样品和4 份奶酪样品，研究羊乳和手工羊乳奶酪中的天然乳酸菌，其中乳酸乳球菌和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ）在新鲜生乳中的分离率较高，而在奶酪样品中，植物乳杆菌和干酪乳杆菌（Lactobacillus cai ）的分离率较高。如表3所示，众多研究结果表明，南美洲地区传统乳制品中乳酸乳球菌为优势菌种之一，并且由于其独特的气候环境，造就了该地区乳酸菌菌种具有独特的益生特性和极高的研究价
值。目前，对于巴拉圭地区传统乳制品的研究很少。本研究阐明了巴拉圭地区传统乳制品中乳酸菌的多样性，为研究巴拉圭地区乳制品中乳酸菌生物多样性提供了理论依据，也为筛选具有独特益生特性的优良菌种提供了借鉴。
表 3 南美洲地区传统乳制品中乳酸菌的多样性分析
Table 3 Diversity of lactic acid bacteria in traditional dairy products
in lected South American countries
乳酸菌
分离菌株数量
巴西[24-25]阿根廷[26]巴拉圭原料乳及环境水牛奶酪原料乳奶酪发酵乳
杜兰肠球菌（Enterococcus durans）35*
北京第一实验小学意大利肠球菌（Enterococcus italicus）61
屎肠球菌（Enterococcus faecium）154859
乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）10
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）2
干酪乳杆菌（Lactobacillus cai）101
put off德氏乳杆菌保加利亚亚种
（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）
10
发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）10
瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）5
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracai）438
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）30
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）1468乳酸乳球菌乳酸亚种
（Lactococcus lactis subsp. lactis）
20
乳酸乳球菌乳脂亚种
（Lactococcus lactis subsp. cremori）
2
格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）44
明串珠菌亚种（Leuconostoc sp.）2
柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）1
肠膜明串珠菌（Leuconostoc menteroides）2815假肠膜明串珠菌
（Leuconostoc pudomenteroides）
8
肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc
menteroides subsp. menteroides）10
沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）28
葡萄球菌亚种（Staphylococcus sp.）22
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）5
解没食子酸链球菌（Streptococcus
gallolyticus）3注：巴拉圭地区数据来源于本研究。
4 结论
从巴拉圭地区亚松森市和东方市采集的8份传统乳制品样品中共分出79株菌，经鉴定分别归属于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc menteroides）、假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pudomenteroides）、解没食子酸链球菌（Streptococcus gallolyticus）、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、斜肠球菌（Enterococcus italicus）、格氏乳球菌（Lactococcus g
arvieae）7 个种。其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）为巴拉圭地区传统乳制品中的优势菌种，占总分离株的68.35%。参考文献：
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