探讨IL-17A在肺纤维化发病机制中的作用-病理学论文-基础医学论文-医学论文
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特发性肺纤维化( idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 病因未明、好发于成人、局限于肺部、进行性进展，以寻常型间质性肺炎为病理特征的一种间质性肺疾病。IPF 确诊后的平均生存时间仅仅 2． 8 ～4． 2 年。由于其发病机制和病因未明，诊断困难，缺乏有效的治疗和较差的预后，因此，积极探讨 IPF的病因或发病机制，进而寻找有效的治疗手段成为目前学术界研究的重要方向。最新研究表明，白细胞介素 17A( interleukin 17A，IL-17A) 作为一种促炎症细胞因子，参与了慢性炎症过程和自身免疫性疾病。Su 等的研究提示，IL-17A 信号通路中的组分有望成为治疗肺纤维化的新的潜在分子治疗靶点。
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本实验旨在探讨 IL-17A 在肺纤维化发病机制中的作用，进而为后续探索分子靶向药物治疗
IPF 的新途径奠定坚实的基础。
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1 材料和方法
1． 1 材料 清洁级雌性 Wistar 大鼠 20 只，体质量 180 ～ 200 g，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司; 戊巴比妥钠为江苏恒瑞医药股份有限公司产品; 博来霉素 A5 为哈尔滨莱博通药业有限公司产品; 兔抗 IL-17 免疫组化试剂盒为 博奥森生物技术有限公司; IL-17A ELISA 试剂盒为 Bio-Ｒad 公司产品; 总 ＲNA 提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品;改良型 ＲPMI1 0 培养基、1 高糖 DMEM 培养基、胎牛血清为 HyClone 公司产品; 引物为上海生工生物工程有限公司产品; ＲNA 逆转录试剂盒、PCＲ 试剂盒为成都博瑞克生物技术有限公司产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 肺纤维化动物模型的建立 20 只雌性 Wistar 大鼠随机平均分成对照组即生理盐水( normal saline，NS) 组和模型组即博来霉素( bleomycin，BLM) 组。参照文献［4］的方法进行造模: BLM 组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠( 40 mg/kg 体质量)进行麻醉，在无菌操作下，钝性分离暴露气管，向 BLM 组大鼠气管注入含 BLM A5( 5 mg/kg 体质量) 的 NS 0． 3 mL，迅速将大鼠直立并旋转，使药液在肺内分布均匀。同条件下以相同的方法将同体积 NS 注入 NS 组大鼠气管。
1． 2． 2 肺组织的留取和病理分析 两组实验动物均于气管内灌注 NS 或 BLM 后 7 d 和
28 d 通过右心室采血各 一半。参照文献［5］的方法得到肺组织和支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 。左肺注入 40 g/L 的多聚甲醛，并置于 40 g/L 多聚甲醛中固定。取 3 块不同部位的肺组织，石蜡包埋后做成切片，厚度为 5 m，切片使用 HE和 Masson 染色来评价其病理改变( 肺泡炎和肺纤维化) ，具体标准主要参考文献［6 －7］中的方法来确定。
1． 2． 3 肺组织 IL-17 的免疫组化染色 肺组织切片脱蜡、水化、修复抗原、血清封闭; 一抗为兔抗 IL-17 单克隆抗体( mAb) 1∶100，二抗为 HＲP 标记的山羊抗兔抗体，DAB 显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。对照组用 PBS 代替一抗。
利用 Leica 系统对免疫组化染色结果进行图像采集，再利用ImagePro plus 6． 0 软件对其进行分析，随机选取 2 个时间点肺组织切片染色区域 5 个高倍视野，计算阳性染色的平均吸光度( A) 值。
1． 2． 4 BALF 细胞计数与分类 参照文献［8］的方法作细胞数测定，行支气管肺泡灌
洗收集 BALF 后取 10 L 细胞悬液充入细胞计数板，用低倍镜计数四角的四个大方格中的细胞数。沉淀细胞涂片，瑞氏染色后行细胞分类，选取 100 个白细胞，按其形态特点进行分类计数，求出各种白细胞所占的百分率，再以细胞总数求得 BALF 中各类白细胞的绝对值。计算公式: 细胞数/L = N/4 10 C 106，其中 N 为 4 个大方格内的白细胞总数，C 为稀释倍数。
1． 2． 5 ELISA 检测 BALF 中 IL-17A 的含量 使用 ELISA 试剂盒对 BALF 中 IL-17A 的浓度进行检测，具体检测步骤按照试剂盒的说明书操作。
1． 2． 6 肺泡巨噬细胞的分离、纯化、培养 行右肺支气管肺泡灌洗收集 BALF，将细胞悬液用含 100 mL/L 小牛血清的ＲPMI1 0 培养液在培养瓶中经 37℃ 、50 mL / L CO2的细胞培养箱内孵育纯化 3 h，弃培养液，将贴壁纯化的肺泡巨噬细胞( alveolar macrophage，AM) 再分别用 DMEM 进行培养。两组AM 均采用 6 孔板进行培养，每组 6 个复孔，每孔细胞数为5 105，培养12、24、48 h 后各收集其细胞和培养上清液，备用( 上清液用作 IL-17A 的检测，细胞用作 IL-17A mＲNA 的检测) 。
1． 2． 7 反转录 PCＲ 检测 AM 中 IL-17A mＲNA 的表达 从PubMed 数据库中获取大鼠 IL-17A mＲNA 全序列，IL-17A 引物由上海生工生物工程公司设计和合成，甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH) 作 为 内 参 照。IL-17A ( 188 bp) ，上 游 引 物:
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5-CTA CCTCAACCGTTCCACT-3， 下 游 引 物: 5-TTCTCAG-GCTCCCTCTTC-3; GAPDH ( 450 bp) ，上游引物: 5-ACCA-CAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物: 5-TCCACCACCCTGTT-GCTGTA-3。采用 TＲIzol 试剂盒提取 AM 总 ＲNA，逆转录反应合成 cDNA，反转录 PCＲ 反应严格按照试剂盒说明书进行，所有样本与 GAPDH 的比值作为 IL-17A mＲNA 相对表达量。
1． 2． 8 统计学分析 采用 SPSS13． 0 软件完成。结果以 x s表示，采用单因素方差分析和 q 检验，所有的比较中，P ＜ 0． 05表示差异有统计学意义。
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2 结果
2． 1 两组大鼠肺组织的病理变化 模型组第 7 天时肺泡腔、肺间质内均可见较多炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽，肺间质可见少量胶原纤维组织; 第 28 天时肺泡腔内渗出较少，肺泡结构被破坏，其间隔增宽显着，细胞外基质增生明显，肺间质大量的成纤维细胞也明显增生，大量胶原纤维沉积，形成广泛的纤维化。与NS 组相比，BLM 组第 7 天时肺泡炎较明显，第 28 天时肺泡炎减轻，而肺纤维化程度较重( 图1，表1) .
2． 2 免疫组化检测肺组织 IL-17A 蛋白的表达 NS组大鼠肺组织中IL-17A 呈弱表达，第7 天、28 天表达量无明显变化，分别为 23． 67 3． 19，24． 26 3． 35，而BLM 组第 7 天、28 天 IL-17A 表达明显增强，分别为103． 48 9． 49，87． 42 7． ，较 NS 组明显
增加，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ，而第 28 天表达较第7 天有所降低( 图 2) 。
2． 3 BALF 中细胞数及细胞类型分析 第 7 天，NS组 BALF 中细胞总数为( 9． 45 0． 76) 个，BLM 组BALF 细胞总数为( 35． 28 2． 76) 个; 与 NS 组比较，BLM 组 BALF 细胞总数明显增高，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ，第 28 天 NS 组中 BALF 细胞总数为( 9． 52 0． 67) 个，BLM 组为( 9． 71 0． 80) 个，两者差异无统计学意义( P ＞ 0． 05) ; 与 NS 组比较，第7 天，BLM 组 BALF 中 AM 比例较小，中性粒细胞和淋巴细胞百分比均明显增加，差异有统计学意义( P ＜0． 05) ; 第 28 天，BLM 组 BALF 细胞分类百分比，与 NS 组相比无显着性差异( P ＞0． 05，表2) ，表明细胞类型基本恢复正常。
2． 4 BALF 中 IL-17A 的测定 第 7 天、28 天，NS组 BALF 中 IL-17A 分别为( 57． 45 6． 68) pg/mL、( 55．49 6．06) pg/mL，BLM 组第 7 天、28 天 IL-17A含量高达( 278．37 13． 99) pg/mL 和( 213． 26 11． 62)pg / mL，与 NS 组相比，均明显增高，差异有显
着统计学意义( P ＜0． 01) ，但第 28 天时 IL-17A 含量较第7 天略有降低，但差异无统计学意义。
2． 5 AM 培养不同时期上清液中 IL-17A 的浓度变化 BLM 7 d、28 d 组 AM 培养前12 h、24 h、48 h 上清液中 IL-17A 的浓度与 NS 组比较，均明显增高，差异有统计学意义( P ＜0． 05，表 3) 。
2． 6 AM 中 IL-17A mＲNA 的表达 BLM 7 d 组、28 d 组各时期 AM 中 IL-17A mＲNA 的表达明显高于NS 组，差异有统计学意义( 图 3、4，P ＜ 0． 05) ; 尤以前 12 h 显着，24 h、48 h 表达逐渐减弱( 图 5) 。
3 讨论
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目前普遍认为 IPF 的发病机制可能是炎症导致肺泡上皮细胞损伤后，上皮细胞异常增生和再上皮化异 常 修 复 最 终 引 起 肺 纤 维 化。白 介 素 17A( IL-17A) 作为一种重要的促炎症细胞因子，其过度表达容易导致慢性炎症和自身免疫性疾病，而抗IL-17A抗体和抗 IL-17AＲ 抗体通过阻断 IL-17A 或IL-17AＲ 则在强直性脊柱炎、银屑病等多种免疫性疾病中显示出一定的疗效。抗 IL-17A 抗体能否在治疗 IPF 中发挥作用呢? 在本实验中，我们研究了肺纤维化大鼠肺组织炎症情况下 IL-17A 的表达，结果表明，在肺纤维化的发生和发展中，肺组织表达IL-17A 和 AM 分泌 IL-17A 均增加，在肺泡炎阶段更为明显，提示 IL-17A 可能促进了肺泡炎的形成，进而参与了肺纤维化形成。该结果为后续研究靶向治疗 IPF 提供了依据。
IL-17A 是 IL-17 家族中重要成员，是重要的促炎症因子。IL-17A 在抵抗某些病原体的入
侵以及 导和维持慢性炎症的过程中发挥了重要的作用。Wilson等研究认为，BLM 导的肺纤维化是由 IL-17A 所介导的，而 IL-17A 的致肺纤维化作用则依赖于 TGF-，在气道内大剂量地注射 IL-17A 可以 导肺纤维化的发生。可见 IL-17A 和其他细胞因子可协同作用于肺纤维化的发生发展。Gas 等同样发现，BLM 所导致的肺损伤早期 IL-17A 表达增加，并通过基因缺陷小鼠和中和抗体处理小鼠证实 BLM 导的早期肺泡炎症需要 IL-17A 和 IL-17A 信号转导通路参与。中和 IL-17A 活性可以改善肺纤维化小鼠肺功能。本实验结果显示，与 NS 组相比，BLM组第 7 天 BALF 细胞总数明显增多，AM 比例明显降低，中性粒细胞及淋巴细胞比例均明显增高; BLM组第 7 天、第 28 天 BALF 和肺组织中 IL-17A 的表达明显升高; 说明 IL-17A 作为炎症细胞因子对中性粒细胞等炎症细胞有较强的趋化聚集作用，参与了肺泡炎和肺纤维化的进程，并且可能起着极为重要的作用。这与其他人的研究结果相互验证。
AM 异常活化可以引起细胞因子异常表达，从而在调节肺部炎症方面有其重要作用，并通过多种途径影响肺纤维化的发展进程。本实验应用 ELISA检测 AM 不同培养时期上清液中 IL-17A 的浓度变化，研究结果显示，与 NS 组相比，BLM 组大鼠 7 d、28 d AM 培养上清
液中 IL-17A 的表达量明显升高，以前 24 h、48 h 更为明显，证实 AM 分泌了 IL-17A，而且经 导刺激后会大量分泌，从而参与了肺纤维化的形成。大鼠 BLM 7 d 组 AM 培养上清液中 IL-17A 的表达量较 28 d 组高，同时也说明 IL-17A 在肺纤维化的形成和演变中可能起重要作用，在肺泡炎阶段发挥的作用比肺纤维化阶段可能更大。应用ＲT-PCＲ 检测 AM IL-17A mＲNA 的表达，其结果显示，与 NS 组相比，BLM 7 d 组、28 d 组培养各时期的表达明显增高，尤以前12 h 显着，24 h、48 h 表达逐渐减弱，说明由于 AM 的体外培养没有了 导剂的继续参与，其 IL-17A mＲNA 的表达逐渐减弱，更进一步证实了 AM 分泌 IL-17A，经 导刺激后会大量分泌参与形成肺纤维化。同样也可以看出大鼠BLM 7 d 组 AM 培养 IL-17A mＲNA 表达量较 28 d 组高，再次说明 IL-17A 在肺纤维化的发生、发展的病理过程中可能起重要作用，在肺泡炎阶段发挥的作用可能更大，而中和 IL-17A 则有可能治疗 IPF。
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