分子生物学综述论文(基因敲除技术)

更新时间:2023-06-10 01:34:04 阅读: 评论:0

现 代 分 子 生 物 学
课 程 论 文
题 目      基因敲除技术     
辣妈辣妹主题曲                           
班  别  生物技术10-2学号 ***********
姓  名    陈嘉杰                     
成  绩                               
基因敲除技术的研究进展
要摘 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此后经历了近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家马里奥•卡佩奇(Mario Capecchi)奥利弗•史密西斯(Oliver Smithies)
英国美国大学留学费用科学家马丁•埃文斯(Martin Evans)因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因敲除技术从此得到关注和肯定,并对医学生物学研究做出了重大贡献。本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词  基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组
前言
基因敲除又称基因打靶,该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改制,具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)以取代目的基因,再筛选出已靶向灭活的细胞,微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠,再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明,使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术,属完全性基因敲除,不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于19
93年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物,被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础,Cre在哪种组织细胞中表达,基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术,其同样以Cre/LoxP系统为基础,利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制,避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 2004年该实验室Cui等又报道了第四代基因工程技术,即可诱导的区域性蛋白质敲除技术,用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能,从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性,达到空前的时间精度,成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。
1. 基因敲除技术简介
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,
除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
2.实现基因敲除的多种原理和方法:
2.1.1 利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初,胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.2条件性基因敲除法
条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[2]。它实际上是在常规的基因敲除的基础上,利用
重组酶Cre介导的位点特异性重组技术,在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”,从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态
生物考研2.1.2.1条件性敲除的原理
利用Cre/LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[发呆英文4]。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP,并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后,通过将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶),产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠,虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP,但靶基因并没有发生其他的变化,故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时,产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应,结果将一个loxP 和靶基因切除。这样,靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性:即Cre 在哪一种组织细胞中表达,靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞;而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种
组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[3]
2.1.2.2 诱导性基因敲除法
诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础,但却是利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点,通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性,从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如:四环素诱导型;干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理:
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒,细菌或其他基因载体,在目标细胞基因组中进
行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞[5,6]。根据细胞的不同,插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入;对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用;噬菌体可用于细菌基因敲除。
2.2.2基因捕获法
基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因,通常是neo 基因,neo 基因插入到ES 细胞染色体组中,并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来,从理论上讲,在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得
2.3.RNAi引起的基因敲除。
exquisite由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达,并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年来,越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。
2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理
双链RNA进入细胞后,能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA,而另一方面双链RNA还能在RdRP (以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA-directed RNApolymera,RdRP)的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链,并和某些蛋白形成复合物,Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以SiRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚合酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个kush核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi,但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA[7]
2.3.2 RNAi基因敲除的优点及应用
.比用同源重组法更加简便,周期大大缩短。
.对于哺乳动物,如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。
peachy>supplychainmanagement.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达,它成为研究信号传导通路的良好工具。
.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因,如可用RNAi来阻断某些基因的表达,来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。
2.4实现基因敲除的其他原理。
除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外,还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和完善过程中,如TFOs(Triple helix forming oligonucleotides)引导的基因敲除术以及反义技术在基因敲除技术中的运用等。随着遗传学,分子生物学理论的发展,新的基因敲除原理也在不断的发现和发掘中。
3.基因敲除技术的缺陷
随着基因敲除技术的发展,早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决,但基因敲除技术始
终存在着一个难以克服的缺点,即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能,其原因包括:一方面,许多基因在功能上是冗余的, 敲掉一个在功能上冗余的基因,并不能造成容易识别的表型,因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能;另一方面,对于某些必需基因,敲除后会造成细胞的致死性,也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
4.基因敲除技术的应用及前景:
.建立生物模型。在基因功能,代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型,从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞,也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠,家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。
.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。
. 提供廉价的异种移植器官。众所周知,器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因圣诞节的英文单词
素,而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子,如果能将产生这些异源分子的基因敲除,那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗,这将为患者带来具大的福音。如:PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α-1,3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a1-3半乳糖基转移酶的基因的2个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子,人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性,从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下,超急性排斥反应即不会再发生[8]
. 免疫学中的应用。同异源器官移植相似,异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥,使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除,换以人的相应基因,那么将产生人的抗体,从而解决人源抗体的生产问题。
>autumn什么意思

本文发布于:2023-06-10 01:34:04,感谢您对本站的认可!

本文链接:https://www.wtabcd.cn/fanwen/fan/78/915700.html

版权声明:本站内容均来自互联网,仅供演示用,请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系,我们将在24小时内删除。

标签:基因   敲除   技术   细胞   研究
相关文章
留言与评论(共有 0 条评论)
   
验证码:
推荐文章
排行榜
Copyright ©2019-2022 Comsenz Inc.Powered by © 专利检索| 网站地图