基金项目：福建省中青年教师教育科研项目(JA14423)；厦门医学院科研基金（Z2013-30）。收稿日期：2018-01-19
作者简介：徐晶晶（1988-），博士，讲师，从事中药新药开发及复方药理学研究，E -mail ：xjj159********@ 。通讯作者：向云亚（1984-），讲师，从事中药新药开发及药物代谢研究，E -mail ： 。优先数字出版时间：2018-03-06；地址：knski/kcms/detail/52.1051.TS.20180306.1410.022.html 。
DOI ：10.13746/j.njkj.2018028
侧柏叶生发酒提取工艺的优化
徐晶晶1，张可擎2，林丽珍1，向云亚1
（1.厦门医学院药学系，福建厦门361023； 2.河南应用技术职业学院，河南郑州450000）摘
要：优化侧柏叶生发酒的提取工艺。采用正交试验设计，以总黄酮含量、槲皮苷含量的综合评分
为指标，考察乙醇体积分数、料液比和提取时间对提取效果的影响。结果表明，优选的提取工艺为乙醇体积分数60%，料液比为1∶12，提取时间12d 。该优选的提取工艺合理可行，侧柏叶生发酒各项指标符合药典规定，工艺重复性好。
关键词：侧柏叶；提取工艺；正交试验；总黄酮；槲皮苷中图分类号：TS262.91；TS261.4
文献标识码：A
文章编号：1001-9286（2018）05-0038-05
Optimization of the Extraction of Cacumen Platycladi in the
Production of Tonic Wine
XU Jingjing 1,ZHANG Keqing 2,LIN Lizheng 1and XIANG Yunya 1
(1.Department of Pharmacy,Xiamen Medical College,Xiamen,Fujian 361023;
2.Henan V ocational College
of Applied Technology,Zhengzhou,Henan 450000,China)
Abstract :The extraction of Cacumen Platycladi was optimized through orthogonal test with total flavonoids content and quercitrin content as the scoring indexes.And the effects of ethanol volume fraction,solid-liquid ratio and extracting time on the extraction were explored.Finally,the best extractio
n conditions were summed up as follows:the volume fraction of ethanol was 60%,solid-liquid ra-tio was 1∶12,and the extraction time was 12d.The optimized extraction was feasible in practice and it met the requirements in the Pharmacopoeia of the People's Republic of China.
Key words :Cacumen Platycladi;extraction process;orthogonal test;total flavonoids;quercitrin
侧柏叶为柏科植物侧柏（Platycladus orientalis (L.)Franco ）的干燥枝梢和叶。中医认为侧柏叶气清香，味苦涩，性寒，归肺、肝、脾经，具有凉血止血、化痰止咳，生发乌发之功效，用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺热咳嗽、血热脱发、须发早白[1]。侧柏叶作为传统的中药，其乌发功能一直被人忽略。而在诸多古今文献中记载其主要功能为乌发和生发，在《本草纲目》中谓其：浸油，生发，烧汁，黑发。和猪脂，沐发长黑[2]。侧柏叶单独或配伍白鲜皮、何首乌、骨碎补等浸酒，浸液外涂患处，治疗脱
发效果良好[3]。鲜侧柏叶浸泡于60%vol 的酒精中，7d 后滤取药液，涂擦毛发脱落部位，每日3次可治疗脂溢性皮炎与脱发、发早白等[4-7]。赵永光等[8]研究认为，侧柏叶的生发乌发作用主要在于侧柏叶总黄酮提取液可激活毛母细胞和促进头皮血液循环，复活毛发生长能力衰退的毛囊和促进血液循环，增加头部的营养成分而发挥养发、生发作用。本实验采用正交试验设计，以总黄酮含量、槲皮苷含量的综合评分为指标，考察乙醇体积分数、料液比、浸提时间对侧柏叶生发酒提取工艺的影响，优化侧柏叶
生发酒的提取工艺。
1材料与方法
1.1材料、仪器
试药：鲜侧柏叶药材购自北京同仁堂，经鉴定为柏科植物侧柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和叶。芦丁(四川省维克奇生物科技有限公司，批号为wkq16101104，纯度＞98%)，槲皮苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号为wkq16080402，纯度＞98%)。水为纯净水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
仪器设备：Waters2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，UV-1800紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；CP124C型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；RT-04型粉碎机，北京兴时利和科技发展有限公司)。
1.2试验方法
见实验步骤及方法。
2结果与分析
2.1侧柏叶总黄酮的含量测定
2.1.1供试液的制备
对照液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10.74mg于小烧杯中，取适量甲醇溶解，转移至50mL容量瓶中，定容至50mL摇匀，即得芦丁对照品母液（每1mL中含无水芦丁0.21mg）。
样品溶液的制备：精密量取5mL侧柏叶酒，置于水浴上蒸干，以甲醇溶解，过滤，滤液至50mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀即得[9]。
2.1.2实验条件的选择
2.1.2.1吸收波长的确定
取侧柏叶酒1号样品溶液10mL置于50mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液2mL，摇匀，放置6min (不断振摇)，加入10%硝酸铝溶液2mL，摇匀，放置6min(不断振摇)，加1mol/L氢氧化钠溶液20mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，采用分光光度计法，200～800nm处扫描，由扫描结果确定测定波长为500nm[10-11]。
2.1.2.2标准曲线制备
分别精确量取标准芦丁溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL和12.0mL，分别置于50mL 容量瓶中，各加水至12mL，添加5%的亚硝酸钠溶液2.0mL，混匀，放置6min，加10%的硝酸铝溶液2.0mL，摇匀，放置6min，加1mol/L的氢氧化钠试液20.0mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，在分光光度计500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得出标准曲线的回归方程。线性回归方程为y=11.735x-0.0101，相关系数R2=0.9996。标准曲线见图1。
2.1.2.3样品含量的测定
吸取待测样液10mL及10mL蒸馏水作为空白对照，分别置于50mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液2mL，摇匀，放置6min(不断振摇)，加入10%硝酸铝溶液2mL，摇匀，放置6min(不断振摇)，加1mol/L氢氧化钠溶液20mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，在分光光度计500nm波长处测定吸光度，对比标准曲线，计算总黄酮含量，结果见表1。
2.1.3重复性实验
取待测样液6份，按照方法2.1.2.3测定样液的吸光度，根据标准曲线的回归方程和稀释倍数，计算侧柏叶酒中的总黄酮含量，得到RSD=2.59%（n= 6），重复性良好。
2.1.4加样回收率实验
取已测定含量的侧柏叶酒样品溶液，按照已知含量的80%、100%、120%加入芦丁标准品，按照方法2.1.2.3测定回收率，结果见表1。
2.2槲皮苷含量的测定
2.2.1色谱条件
图1
芦丁标准曲线
Kromasil C 18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm ），流动相为甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢钾溶液-冰醋酸（40∶60∶1.5），检测波长254nm [1，12]，体积流量1.0mL/min ，柱温25℃，进样量10μL ，见图2。2.2.2
对照品溶液的制备
精密称取槲皮苷对照品4.83mg ，置于50mL 棕色容量瓶中，添加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，
得储备液。2.2.3
供试品溶液的制备
精密量取侧柏叶酒1mL ，置于10mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，进样前用0.45μm 微孔滤膜滤过。2.2.4
生活大爆炸第3季
线性关系考察
精密吸取槲皮苷对照品溶液0.4mL 、0.6mL 、
注：1.槲皮苷；A.槲皮苷对照品；B.供试品。
图2
侧柏叶酒的
HPLC
0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得槲皮苷系列对照品溶液。将各对照品溶液，按2.2.1项中色谱条件测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得槲皮苷回归方程为Y=27595X+629（R2=0.9996），线性范围为3.864～13.524μg。
2.2.5精密度试验
分别取2.2.4项中槲皮苷高、中、低3个质量浓度的对照品溶液，按照2.2.1项中色谱条件，每个浓度分别重复进样5次，槲皮苷高、中、低质量浓度的RSD分别为0.2%、0.6%、1.0%，表明仪器的精密度良好。
2.2.6稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、12h、24h按照2.2.1项中色谱条件进样，测得槲皮苷质量浓度的RSD为0.6%，表明供试品溶液在24h 内稳定。
2.2.7重复性试验
取侧柏叶酒样品，按照2.2.3项中处理方法平行制备5份，按照2.2.1项中的色谱条件进样，计算含量。其RSD为0.8%，表明该方法重复性良好。2.2.8加样回收率试验
精密量取已知含量的侧柏叶酒1mL，分别按含量的80%、100%、120%加入槲皮苷对照品溶液，按照2.2.1项中的色谱条件进样，计算槲皮苷的平均加样回收率为100.60%、100.30%、101.01%，RSD为1.89%、1.49%、1.19%，结果见表2。
2.3侧柏叶生发酒制备工艺的优化
选用L9(34)正交试验，以总黄酮含量、槲皮苷含量的综合评分为指标，考察乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)对提取效果的影响，从而确定最佳提取工艺条件。权重分配总黄酮含量占0.7，槲皮苷含量占0.3。具体计算方法为9个样品中，每一个样品的总黄酮、槲皮苷含量分别除以9个样品中总黄酮、槲皮苷含量的最大值，然后乘以权重系数，得到总黄酮、槲皮苷含量在该样本中的综合评分的贡献值，同一样品的总黄酮、槲皮苷含量贡献值之和即为该样品的综合评分[13]。因素水平见表3，试验安排及结果见表4，方差分析见表5。由表4极差分析结果可知，各因素对结果的影响顺序为C＞A＞B，即提取时间＞乙醇体积分数＞料液比。由表5方差分析可知提取时间对提取工艺有显著影响，并根据综合评分结果，选择最优工艺条件A1B3C3，即乙醇体积分数60%，料液比为1∶12，提取时间12d。
2.4验证试验
英语小对话称取新鲜侧柏叶药材粉末各6g，按最佳工艺条件A1B3C3重复3次试验，验证该工艺条件的稳定性，结
果总黄酮的平均含量为12.56mg/g，槲皮苷的平均含量为1.35mg/g，结果无显著性差异，证明该工艺稳定可行。
表2槲皮苷的加样回收率试验
样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9样品中槲皮苷含量
(mg)
ivr0.1422
0.1422
0.1422
0.1422
0.1422
0.1422
0.1422
0.1422
0.1422
加入对照品
(mg)
0.1130
0.1130
0.1130
0.1420
0.1420
0.1420
0.1710
0.1710
0.1710
测得量
(mg)
0.2512
0.2587
0.2603
0.2862
0.2803
0.2887
0.3165
0.3125
0.3201
回收率
(%)
98.43
101.37
102.00
100.70
98.63
101.58
天津会计从业资格证
101.05
99.78
102.20
平均回收率
(%)
100.60
100.30
101.01
SD
1.90
1.52
1.21
RSD
(%)
1.89
1.49
1.19
表3侧柏叶生发酒的提取工艺正交试验因素水平
水平
1
2
3
因素
A：乙醇
(%vol)
dyp是啥
60
70
gma
80
B：料液比
(g∶mL)
1∶8
1∶10
1∶12
C：提取时间
(d)变形金刚1主题曲
4
8
12
3讨论
白发的病因与发病机理复杂，现代医学研究认为，可能与遗传、衰老、疾病等导致的黑素干细胞衰老、黑素细胞减少等有关，机制包括bcl-2基因缺失、氧化损伤、氧化应激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosina)表达量减少或活性降低是一个重要的因素[14-15]。
侧柏叶中所含化学成分复杂，包括黄酮类化合物、鞣质和挥发油等，可应用于医药、农药、化妆品等领域[8]。在诸多古今文献中记载其主要功能为乌发和生发，其中最常用的方法就是将鲜侧柏叶浸泡于高浓度的酒精中，滤取药液，涂擦毛发脱落部位。但该提取工艺的参数尚缺乏实验依据，都是根据前人经验而得，本研究考察了乙醇体积分数、料液比、浸提时间对侧柏叶生发酒提取工艺的影响，优化了侧柏叶生发酒的提取工艺。
侧柏叶主要含槲皮苷、杨梅树素、扁柏双黄酮、穗花杉双黄酮等黄酮成分[16]。这些成分化学结构中都有可与铝离子生成具色络合物的供电子体。因此，本文用比色法测定侧柏叶中总黄酮成分含量。《中国药典》收录侧柏叶生品中槲皮苷的含量测定方法，本实验同时测定两者含量的变化情况，可为侧柏叶生发酒的质量控制提供科学依据。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：
中国医药科技出版社,2015：215-216.
[2]陈兴芬.侧柏叶化学成分提取及活性功能研究[D].南
京：南京师范大学,2011.
[3]林朝亮，殷学超，黄育志.中医药治疗脂溢性脱发近况
[J].国医论坛,2002,17(6)：50-51.
[4]罗仁，秦建增.单味中药疗法[M].4版.北京：人民军医出
版社,2015：307-310.
[5]谢文英，李素领，车志英.异病同治临证经验集萃——
162味中药的奇方妙用[M].上海：第二军医大学出版
社,2007：413-415.
[6]何国樑.中华药酒养生大全[M].广州：广州出版社,
2006：49.
[7]吴蓓玲.侧柏叶、皂角外洗可治脱发吗?[J].中医健康养
生,2017(5)：50-51.
[8]赵永光，赵莹，张建平，等.侧柏叶总黄酮在功能性洗发
香波中的应用研究[J].安徽农业科学,2008,36(24)：
10295-10296.
[9]金红，段辉，何亚敦，等.保健酒中总黄酮测定方法的比
tear
选[J].酿酒科技,2009(2)：79-81.
[10]吴婷，张丽.分光光度法测定银杏酒中总黄酮的含量
[J].南京中医药大学学报,2005,21(2)：129-130.
[11]吴灿，夏延斌，唐鑫.分光光度法测定莲子酒中的总黄
酮[J].农产品加工(学刊),2013(4)：48-53.
[12]吴怀恩，甄汉深，韦志英，等.侧柏叶不同炮制品中槲皮
苷与槲皮素的含量测定[J].时珍国医国药,2009,20(2)：
354-356.
[13]王勇，赖伟勇，魏娜，等.单因素和正交试验法优选柠檬
草油超临界CO2萃取条件[J].海南医学院学报,2012,
18(3)：305-307.
[14]付庆霞，王海苹.白发病因与发病机理研究现状[J].光
明中医,2009,24(2)：375-377.
[15]INOMATA K,AOTO T,BINH N T,et al.Genotoxic
2013年12月六级真题
stress abrogates renewal of melanocyte stem cells by
triggering their differentiation[J].Cell,2009,137(6)：
1088-1099.
[16]张国琴，刘延红，潘田琅，等.侧柏叶中总黄酮成分含量
测定[J].西北药学杂志,2001,16(3)：107-108.
表4侧柏叶生发酒的提取工艺正交试验试
验号1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1/3 k2/3 k3/3 R
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
0.84
0.85
0.79
0.06
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
0.81
0.84
0.83
0.03
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
0.68
0.84
0.96
0.28
总黄酮
含量
(mg/g)
8.50
11.36
12.94
11.71
12.78
9.18
12.07
9.08
10.42
槲皮苷
含量
(mg/g)
0.88
1.17
1.39
1.13
cbb
1.32
0.97
1.21
0.89
1.03
综合
评分
0.65
0.87
1.00
0.88
0.98
0.71
0.92
0.68
0.79
表5综合评分方差分析
因素
A B C 离差平方和
（SS）
0.006
0.001
0.124
自由度
（f）
2
2
2
F
1.750
0.331
37.811
P
＞0.05
＞0.05
＜0.05
