走进美国
·实验研究·
icc是什么意思高压氧保存对离断肢体保护作用实验研究
张 智 蒋祖言3 王爱民3 郑世刚33
摘 要 目的：探讨高压氧(HBO )保存对离断肢体的影响。方法：大鼠右后肢离断后，分别放在HBO 下和室内空气
英语4级作文
中保存，测定骨骼肌Na +-K +-A TP 酶和Ca 2+-A TP 酶活性并观察骨骼肌超微结构改变。再选用大鼠30只进行肢体离断后原位再植，随机分为对照组、HBO 组、室内空气组。于再植术后24h 测定每份血清肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶的含量。到术后第10d 评价肢体成活率。结果:HBO 中保存对酶活性和超微结构的影响皆明显优于室内空气中保存。再植术后24h 血清酶含量，高压氧组较室内空气组低(P <0.01)。HBO 组成活率为100%，而室内空气组为50%，有显著差异(x 2=6.67,P <0.05)。结论:HBO 保存对大鼠离断肢体具有保护作用。
关键词 高压氧; 骨骼肌; Na +-K +-A TP 酶; Ca 22+-A TP 酶; 断肢再植中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2002)06-0566-03
E ffects of H yperb aric Oxygen Prervation on the Amputated Limbs of R at :An Experimental Study ∥
ZHA N G Zhi ,JIA N G Zu 2yan ,W A N G A i 2min ,et al.Depart ment of Orthopedic S urgery ,The 89th Hospital PL A ,Weif ang S handong 261021
Abstract Objective :To elucidate any possible benefit effects of Hyperbaric Oxygen (HBO )prervation on amputated limbs.Methods :The animals with am puted right hindlimbs for 6hours were divided randomly into 2groups and 6rats in each.The right hindlimb was placed in room air or in HBO both at (22.5±2.5)℃.Na +-K +-A TP a and Ca 2+-A TP a ac 2tivities were determined and ultrastructure of the skeletal muscle were obrved.The hindlimbs were chon to be re planted by microvascular anastoms after storage in either room air or HBO for 6hours.Control group :tho with immediate replantation after the hindlimb amputated ,HBO group :tho with replantation of the hindlimb after storage in HBO for 4.5hours ;Room air group :tho with replantation of the hindlimb after storage in room air for 4.5hours ;At 24th hour following replantation ,each rologic sample taken from artery of tail was analyzed for creatin phosphokina (CP K ),lactate dehydrogena (LDH )and glutamic -oxaloacetic transamina (G O T ).At the 10th day postoperativly survival rates of the replanted limbs were calculated.Results :The enzyme activities and ultranstructure storage in HBO were significantly better than in room air.The levels of en 2zyme storage in HBO were lower than in room air at 24th hour followin g replantation.Comparisons of survival rates between group HB
O and group room air demonstrated significant diference (100vs 50percent x 2=6.67,P <0.05).Conclusions :HBO had protective effects on amputated limbs of rats.
K ey w ords Hyperbaric oxygen ; Skeletal muscle ; Na +-K +-ATP a ; Ca 2+ATP a ; Replantation of is olated limbs
作者单位：解放军第89医院骨科中心，山东潍坊 261021
3重庆第三军医大学附属大坪医院骨科33重庆第三军医大学附属大坪医院高压氧科
作者简介：张智(19652)，男，内蒙古人，主治医师，医学硕士。研究方
向：创伤显微外科修复。电话:(0536)8389896
解除肢体离断后组织缺血性损伤的根本办法是尽
妥协的意思快重新恢复血供，但是在血供不能立即恢复的情况下，如何对离断肢体保存，以降低组织的缺血损害，延缓肌组织变性、失活，对延长再植时限，确保断肢再植的成活十分重要，目前断肢保存措施主要有：低温冷藏，药物灌注及器官保存液等方法。本文对H BO 保存大鼠离断肢体进行了研究，以探讨其对离断肢体的保护作用。
1 材料与方法1.1 实验动物与方法
健康Wistar 大鼠12只，体重(300±20)g ，将右后肢离断后，按缺血6h 随机分为两组。室内空气组：右后肢离断后放在室内空气中保存:H BO 组：右后肢离断后置于H BO 中保存。保存至6h 取部分三头肌进行Na +-K +-ATP 酶和Ca 2+-ATP 酶活性测定和肌组织超微结构的观察。再选用Wistar 大鼠30只进行肢体离断后原位再植，随机分为三组，每组10只。对照组：肢体离断后立即再植；室内空气组：肢体离断后在室内空气中保存4.5h 开始再植;H BO 组：肢体离断后在高压氧舱内保存4.5h 开始再植，因再植约需1.5h ，所以保存时间包括手术时间。室内空气与高压氧舱内温度均为(22.5±2.5)℃，相对湿度均为(65±15)%。
1.2 离断肢体缺血模型
beside是什么意思
1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位并固定四肢，常规消毒后，在腹股沟韧带下5mm处做平行于腹股沟韧带的环行切口，切开皮肤及皮下组织，分离出股动、静脉，切断股神经，在腹股沟韧带稍下方结扎动、静脉，最后离断整个肢体并用湿盐水纱布包裹，按分组情况保存不同时间。
1.3 高压氧操作
高压氧舱采用GY Q-A-I钢制实验动物舱，肢体放入高压氧舱内，先纯氧洗舱8～10min，然后开始匀速加压10min～3.0AT A，舱内氧浓度为(95～98)%。稳压预定时间后，开始匀速减压，减压时间为15～20min。
1.4 断肢再植
再植时，将大鼠再次用1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，消毒铺单。先将股骨干缩短5～8mm，用克氏针进行髓腔内固定，用4/0线缝合肌肉，最后在手术显微镜下用10/0无损伤尼龙针线进行血管端-端间断吻合，先静脉，后动脉。吻合血管时用100u/ml肝素生理盐水冲洗。在松开血管夹后，用棉球轻压吻合口5min，吻合口漏即停止，观察20min，血管通畅良好再缝合皮肤。
1.5 观察内容
1.5.1 骨骼肌超微结构改变
取大鼠后肢一小块三头肌，进一步切成1mm×1mm×3mm的5个组织块，用3%戊二醛固定,1%锇酸进行后固定，经乙醚、丙酮逐级脱水后，用环氧树脂618纵行包埋，超薄切片，经醋酸钠—柠檬酸钙双重染色后，应用日产J EM—2000EX型透射电镜观察。
1.5.2 骨骼肌Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性测定
fridge是什么意思取100μl肌组织匀浆液，按南京建成生物工程研究所生产ATP酶试剂盒的使用说明逐步操作进行测定，酶活力以μProt-1·h-1表示。
1.5.3 血清酶含量测定
再植术后24h，断尾取血2ml，用美国产Bakm CX-4型全自动生化分析仪测定每份血清肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(G OT)的含量。
1.5.4 肢体成活评价
术后第10d，再植肢体皮肤颜色红润，皮温正常和略比健侧高，说明肢体成活。如果在术后10d内大鼠死亡或再植肢体变紫发黑，表明肢体坏死。
1.6 统计学处理
所有数值均以平均值±标准差( x±s)的形式表示，用第四军医大学卫生统计学教研室《SPLM》软件，进行t检验分析。两样本率的比较用x2检验。
2 结 果
2.1 断肢骨骼肌超微结构改变
缺血6h，室内空气保存组骨骼肌表现为质膜下水肿，线粒体明显肿胀并有髓样小体形成，肌质网扩张明显，肌原纤维排列紊乱，部分断裂，核染色质凝集明显；经HBO保存组骨骼肌表现为线粒体肿胀，肌质网扩张，肌原纤维排列较整齐，明带增宽，核染色质分布较均匀，偶见凝集、边移现象。说明断肢骨骼肌在HBO条件下保存明显优于室内空气中保存。
2.2 骨骼肌Na+-K+-A TP酶和Ca2+-A TP酶活性变化
HBO中保存断肢的骨骼肌酶活性较室内空气中保存者要高，差异有非常显著性(P<0.01)(见表1)，表明在HBO条件下能延缓酶活性下降。
2.3 术后24h血清酶含量变化
再植术后24h血清酶含量变化见(见表2)。表明缺血6h术后各组血清酶CP K、LDH、GO T均比对照组增高，而在高压氧下保存的断肢比在室内空气中保存的要低，差异有非常显著性(P<0.01)。
表1 Na+-K+-A TP酶和Ca2+-A TP酶活性变化(n=6x-±sμProt-1·h-1)组 别Na+-K+-A TPa Ca2+-A TPa
HBO Room air
P
5.265±0.216
4.486±0.214
<0.01
4.879±0.370
3.942±0.111
<0.01
表2 术后24h血清酶含量变化(n=10x-±s IU/L)
组 别CP K LDH G O T
Control HBO Room air
539.9±106.3
businessmanagement 778.8±140.13
rakuten
1678.6±320.43△
516.8±276.0
653.8±117.2
1147.1±335.33△
99.8±74.6
439.1±198.1
688.6±133.33△
3P<0.01vs control △P<0.01vs HBO
2.4 肢体成活情况
再植肢体从术后第1d开始肿胀，到术后第2、3d 肿胀达到高峰，第7d开始减退，但是对照组和HBO组肿胀程度较轻。其成活率均为100%，而室内空气组有2只大鼠在术后第2d死亡，有3只大鼠于术后第4、5d再植肢体坏死，成活率为50%。有显著差异(x2 =6.67,P<0.05)。
3 讨 论
用HBO保存离体器官始于六十年代，通常是高压氧和其他保存技术联合应用，表明高压氧有一定的作用。后来通过HBO对脑组织代谢和孤立酶系统影响的研究，表明HBO能抑制或使特定酶系统失活从而改变细胞的反应，提出低水平需氧代射可维持易受损细胞膜的稳定性，防止细胞膜主动转运能力的丧失，延缓A TP降解，防止细胞肿胀，甚至细胞死亡。
在肢体所有组织中，肌肉对缺血缺氧最为敏感，断肢再植时限主要取决于肌肉。离断肢体骨骼肌的结构表现出一种缺血改变，分布呈局灶性。即线粒体肿胀、嵴紊乱断裂空泡化、肌质网扩张，核染色质聚集边移，这些变化在早期尚属可逆，如果出现质膜破裂、肌原纤维断裂，核固缩、溶解等征象，则表明细胞步入死亡状态。实验证明，缺血6h，室内空气保存组骨骼肌表现为质膜下水肿，线粒体明显肿胀并有髓样小体形成，肌质网扩张明显，肌原纤维排列紊乱，部分断裂，核染色质凝集明显；而经HBO保存组骨骼肌表现为线粒体轻度肿胀，肌质网扩张，肌原纤维排列较整齐，明带增宽，核染色质分布较均匀，偶见凝集、边移现象。说明断肢骨骼肌在HBO条件下保存明显优于室内空气中保存。
Na+-K+-A TP酶和Ca2+-A TP酶是一种膜固有蛋白质，是骨骼肌的两个功能酶1。其活性对维持膜稳定，保持细胞膜内、外离子梯子，藕合糖及氨基酸运输都具有重要意义，酶活性下降是膜结构损伤的敏感指标。肢体离断后组织处于缺血状态，氧供应缺如，肌肉内高能磷酸盐明显消耗，而乳酸及乳酸
plumbing盐明显增加，糖原消耗殆尽,A TP合成障碍，能量供给减少，导致骨骼肌Na+-K+-A TP酶和Ca2+-A TP酶活性下降，乃至停止转运，进而引起一系列细胞代谢与膜电位紊乱，以致细胞结构发生变化、甚至失活。本实验证明,HBO组的酶活性较室内空气组高，差异具有显著性。说明HBO能延缓酶活性下降，从而使细胞继续保持低钠、低钙水平，减少细胞水肿，故有利于断肢再植的成活。在HBO条件下保存的肢体再植术后成活率为100%，明显比室内空气组高。
正常情况下细胞内液、线粒体或溶酶体内酶浓度很高，一般不能透出细胞膜，故血清中浓度很低或无。缺血后，膜泵停止，离子转运系统受损伤，细胞和线粒体肿胀，线粒体嵴的结构破坏，线粒体膜及肌细胞膜通透性增高甚至破坏，细胞内酶得以释放入血。骨骼肌细胞内含有丰富的CP K、LDH、GO T，其中以CP K含量最多，当肢体缺血达到一定程度，骨骼肌细胞将受到损伤，细胞膜通透性增高，血供恢复后，细胞内酶释放入血。因此血清中酶含量的变化可作为缺血后骨骼肌细胞损伤的指征。Presta等2采用兔后肢止血带缺血模型，测定经不同时间温缺血后再灌注时血清内CP K、LDH动态变化，表明血清内酶含量与缺血时间呈正相关，再灌注后24h酶含量达到高峰，第7d恢复到正常水平。本实验因大鼠较小，未进行连续采血，只选择再植术后24h取尾动脉血测定血清中酶含量，结果显示，随缺血时间延长，再植术后24h血清酶含量逐渐升高，尤以CP K升高更为显著，但是HBO组比室内空气组低，差异有显著性，说明在HBO条件下保存，能减轻断肢骨骼肌损害。
Edwards等3认为HBO环境保护了断肢的磷酸盐、糖原等高能物质，使骨骼肌内有较高的能量储备。Z
emmel等4证明HBO保存能明显延缓断肢骨骼肌的p H值下降，有利于防止再植术后代谢性酸中毒发生。本实验以大鼠断肢骨骼肌超微结构、Na+-K+-A TP 酶和Ca2+-A TP酶活性及肢体再植术后成活率和血清酶含量变化作为观察指标，证明HBO保存明显优于室内空气中保存，对离断肢体具有有效保护作用。HBO作用的机制及HBO与低温灌注联合保存对离断肢体的影响将有待进一步研究。
女孩的英文
参考文献:
〔1〕 顾玉东，李继峰，袁伟，等.离断肢体血管与肌肉保护的实验研究J.中华创伤杂志.1996,12:2～5.
〔2〕 Presta M,Ragnotti G.Quatification of damage to striated muscle after normothermic or hypothermic ischemia.Clin
ChemJ.1982,27(2):297～314.
〔3〕 Edward RJ,Im MJ,Hoopes J E.E ffect of hyperbaric oxy2 gen prervation on rat limb replantation.A Preliminary re2
port J.Ann Plast sur g,1991,27:31～35.
〔4〕 Zemmel NJ,Amis L R,Sheppard FR,et al.A temporal analysis of the effects of pressurized oxygen(HBO)on the
p H of amputated muscle tissue J.Ann Plast Sur g,1998,
40:624～631.
(收稿:2001209217 修回:2002202218)
