微流控芯片在表面等离子体共振生物传感器中的应用
骆亦奇
【摘 要】作为众所周知的生物传感器技术,表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)正在被越来越普遍地用于实现各种生物化学检测方法,特别是用途广泛的固相表面生物检测(Solid-Pha Bioassay).SPR对样品进行非标记检测,能够用于测量生物化学反应全过程的反应动力学.为了提高SPR的检测效率,通常将微流控技术(Microfluidics)与SPR相结合,即在SPR生物传感器中使用微流控芯片(Microfluidic Chip)作为反应装置.基于微型化带来的优势,使用微流控芯片作为反应装置可以有效地缩短生物化学检测方法的反应时间,并减少样品消耗.微流控芯片还可以平行排布相同的结构单元,提高SPR生物传感器的检测通量.因此,使用微流控芯片作为反应装置是SPR生物传感器,特别是商品化的SPR生物传感器的发展趋势.
opgw2020小学几号开学【期刊名称】《大学化学》
【年(卷),期】2010(025)001writings on the wall
综合英语一
【总页数】emotionless12页(P1-12)
【作 者】骆亦奇
cabletie【作者单位】斯坦福大学化学系,美国加利福尼亚,94305
【正文语种】中 文
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是当今应用最普遍的非标记光学生物传感器(Label－Free Optical Bionsor)技术，在生物和化学工业特别是制药工业中有很广泛的应用。SPR不需要对被测物进行标记的优点使其可以测量生物活性分子在无修饰条件下的反应动力学。因此，SPR适用于高通量生物活性分子特别是小分子的筛选，微量未知物的分析，以及在线样品检测。由于其广泛的应用价值，SPR生物传感器(SPR Bionsor)的商品化已有近20年的历史［1－3］。
SPR的工作原理是基于入射光激发的金属/电介质界面的电子集团性共振现象。SPR生物传感器中的电介质通常是含有生物活性分子的溶液。金(Au)是最普遍使用的金属材料，这不仅是因为金具有适合于SPR用途的物理性质，也由于金具有稳定的化学性质且易于进行表
面功能化。金的表面可以通过自组装膜方法或者吸附方法固定生物活性分子，实现SPR生物传感器的生物分子识别和捕捉功能。在SPR生物传感器的测量装置中，p型偏振入射光被高折射率棱镜(Prism)耦合到金属膜(Metal Film)与溶液的界面上，入射光的能量在金属/溶液界面上被金属自由电子组成的等离子体(Plasmon)吸收。高折射率棱镜的作用是调节入射光的动量以达到与金属/溶液界面的模式匹配，使入射光能够共振激发金属自由电子的集团性震荡。等离子体的能量沿着金属/溶液界面向附近传播，以热能的形式消散，所以反射光的能量小于入射光的能量。在垂直于金属/溶液界面的方向上，等离子体的能量以消逝波(Evanescent Wave)的形式存在，通常这个消逝波的衰减距离在500nm以内。由于入射光和金属/溶液界面的耦合条件与消逝波范围内的溶液的折射率密切相关，可以用SPR测量金属/溶液界面邻近区域内的折射率。在实际应用中，通常用改变入射光角度的方法来改变到达金属/溶液界面的入射光动量。当入射光角度达到共振角时，入射光与等离子体达到最佳耦合条件，金属自由电子与入射光产生共振能量传递，入射光的能量几乎完全转换成等离子体的能量，反射光的能量达到最低。SPR光谱图就是反射光与入射光的相对强度(Reflectivity)对于入射光角度作图得到的曲线，从曲线的最低点可以读出共振角的数值。共振角的数值取决于金属/溶液界面邻近区域内的折射率，通过记录共振角随时间的变化，可
以实时测量该区域内的折射率变化。对于SPR生物传感器来说，折射率变化由金属/溶液界面邻近区域内的生物化学反应引起，是衡量反应进程和反应动力学的有效指标。因为生物化学反应中的分子变化会引起反应所在区域的折射率变化，所以SPR生物传感器不要求对被检测的分子进行标记，有效地简化了样品制备过程。
SPR的测量装置可以通过两种带有棱镜的结构来实现，即按照棱镜－溶液－金属接触顺序的Otto结构和按照棱镜－金属－溶液接触顺序的Kretschmann结构。Otto结构中的溶液层厚度很小，给测量装置的制造增加了难度。因此，现在大部分SPR生物传感器尤其是商品化的SPR生物传感器的测量装置采用较易实现的Kretschmann结构。经典的采用Kretschmann结构的SPR生物传感器的测量装置如图1所示。理想的SPR光谱图如图2所示，从图2中SPR曲线的位置变化可以读出金属/溶液界面邻近区域内进行的生物化学反应引起的SPR信号变化。在实时测量反应进程时，SPR信号既可以是共振角的变化，也可以是在固定的入射光角度下测量由于共振角变化引起的反射光与入射光的相对强度变化。在SPR生物传感器的测量装置中进行的生物化学反应，可以用SPR传感器谱图(Sensorgram)即SPR信号关于时间的图谱来记录。
生物化学检测方法中的固相表面生物检测(Solid－Pha Bioassay)是SPR生物传感器的主要应用方向。固相表面生物检测通过在固相表面上进行配体物(Ligand)分子与分析物(Analyte)分子的相互作用(Interaction)来实现。通常情况下这种相互作用是可逆的，包含了配体物分子与分析物分子的结合反应(Association)和解离反应(Dissociation)。固定在固相表面上的配体物分子可以识别并且结合与之接触的液相中的分析物分子，将液相中的分子有选择性地富集到固相表面上(图1)。同时，由于这种相互作用是可逆的，当液相中的分析物分子数量下降时，在固相表面上已经结合的配体物分子与分析物分子可以进行解离反应，使得分析物分子重新回到液相中。对于测量范围在金属/溶液界面邻近区域内的SPR来说，用于固相表面生物检测可以有效地发挥其长处，特别是不需要对被检测的分子进行标记的优点。因此，自从SPR生物传感器的概念提出以来，大部分SPR生物传感器，特别是商品化的SPR生物传感器用于实现固相表面生物检测。在学术界和工业界的应用中，SPR生物传感器已经可以通过固相表面生物检测来测量各种生物活性分子之间的亲和力，包括大分子与大分子之间的亲和力以及大分子与小分子之间的亲和力［4－7］。
在用于实现固相表面生物检测时，SPR生物传感器的测量装置需要执行3个主要反应步骤:①将可以选择性结合分析物分子的配体物分子固定在金属膜表面上。② 将流动的分析物
溶液与金属膜表面接触，使得配体物分子与分析物分子在金属膜表面上进行相互作用，包括结合反应和解离反应。分析物是SPR生物传感器直接测量的物质，在常规的固相表面生物检测中，分析物溶液等同于样品溶液，分析物就是样品中的被测物。这个步骤可以称为结合步骤。③将流动的空白反应溶液(Running Buffer)与金属膜表面接触，使得在金属膜表面上的配体物分子与分析物分子进行解离反应。这个步骤可以称为解离步骤。在结合步骤中，开始时配体物分子与分析物分子只进行结合反应，随着金属膜表面上分析物分子数量增加，解离反应开始进行并且和结合反应同时存在，在反应时间充足的情况下，两者的速率逐渐趋于相等，相互作用接近动态平衡状态(Equilibrium)。在解离步骤中，由于空白反应溶液中没有分析物分子，理论上在解离反应进行的同时不会有结合反应发生。因此通过解离步骤的结果可以准确地得到解离反应的动力学参数，然后综合结合步骤和解离步骤的结果可以得到结合反应的动力学参数。理想的固相表面生物检测的SPR传感器谱图如图3所示，SPR信号的上升阶段显示了配体物分子与分析物分子的结合步骤，下降阶段显示了随后的解离步骤。SPR信号的变化幅度显示了金属/溶液界面邻近区域内总的分子数量变化，当配体物分子与分析物分子的相互作用达到平衡状态时，SPR信号的变化幅度可以用来计算分析物分子在样品溶液中的浓度。在主要反应步骤之外，测量装置也需要执行一些bakery
辅助反应步骤，包括在固定配体物分子之前活化金属膜表面和在固定配体物分子之后清洗金属膜表面。由于主要反应步骤所需的配体物、分析物和辅助反应步骤所需的物质以溶液的形式进入SPR生物传感器的测量装置进行各种反应，这些溶液可以称为用于固相表面生物检测的反应溶液。
SPR生物传感器技术在快速发展中。随着SPR测量方法的渐趋成熟，如何提高测量装置的效率成为革新的关键。SPR生物传感器的主要应用方向是高通量快速检测，微型化的测量装置是提高检测通量和速度的有效途径，理由是:①通常SPR生物传感器中的生物化学反应在流动中的溶液和功能化的金属膜表面上进行，所以测量装置的微型化可以提高传质效率，以此加快反应速率，同时提高检测速度［8－9］。②由于SPR的测量面积有限，测量装置的微型化可以增加单位面积上的反应器单元，提高SPR生物传感器的检测通量(Throughput)。③测量装置的微型化减少了检测所需的样品量，可以减少对微量样品的稀释程度，间接地改进SPR生物传感器的最低检测限(Limit of Detection)。所以，微型化的测量装置符合SPR生物传感器的要求并且从一开始就在其中应用。近年来，微流控技术(Microfluidics)的迅速发展提供了制造复杂的微流控芯片(Microfluidic Chip)的方法，推动了应用微流控芯片作为微型化的测量装置的SPR生物传感器的发展。
format微流控技术是研究设计制造微型化的实验装置(微流控芯片)并将其应用于以流体为载体的物理、化学、生物实验的学科。自从20世纪90年代初被提出以来，微流控技术已经成功地将大量传统的化学和生物实验工具实现在微流控芯片上［9－11］，例如高效液相色谱、生物活性材料合成、聚合酶链式反应、固相萃取、蛋白质结晶、单分子光谱等。作为传统实验工具实现微型化的平台，微流控芯片显示出了以下优势:高通量，快速，低样品消耗，体积小，一次性使用，以及易于实现自动化。微流控芯片的优势来自于微型化和液体在小尺度情况下的物理性质。微型化不仅缩小了实验装置的体积，减少了样品消耗，还拉近了各个功能单元的距离，便于将不同的实验工具在微流控芯片中连接起来实现自动化。同时，在微型通道里流动的液体，具有低Reynolds数流动的特点［12］。跟大尺度情况下相比，液体的流动受惯性力的影响下降，受黏滞力的影响上升。所以，液体在大部分微流控芯片中的流动类型属于层流，具有稳定的流场，可以较为准确地进行控制。
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