专论与综述Reviews
收稿 2002-10-24 修定 2003-01-20资助 国家林业局/9480国际引进项目(99-04)。
* 通讯作者(E -mail:fenglan -,T el:010-********)。
植物抗冻蛋白和抗寒基因表达的调控
郭惠红 高述民 李凤兰
*tome
郭蔚岚(北京林业大学生物学院，北京100083)
Plant Antifreeze Protein and Regu lation of Plant C old -resistant G ene Expression
GU O Hu -i Hong,GAO Shu -M in,LI Feng -Lan *,GUO We-i Lan (College of Biolog y ,Beij ing Forestry University ,Beij ing 100083)提要 综述了植物抗冻蛋白及抗寒基因表达调控的最新研究进展，并就此领域存在的问题作了展望。关键词 抗冻蛋白；抗寒基因；表达调控
植物在自然界中生长，必然会或多或少地受到一些不良环境的胁迫，其中低温不仅严重影响了农作物及园艺植物等的产量，而且极大地限制了这些植物的分布。许多温带植物经过一段时间的非冰冻低温适应后，即冷驯化后，抗寒力提高，这种抗寒力的大小因植物种类而异[1,2]。植物抗寒力具有潜在的遗传特性，冷驯化能诱导这种潜能的表达并发挥植物的最大抗寒力[3]。研究者们发现，植物在冷驯化过程中，不仅体内生理和生化过程发生变化，而且许多受低温调节的特异蛋白和mRNAs 也被诱导表达。目前人们对后者的兴趣更大，因此对这些特异蛋白和基因的结构、功能及抗寒机制展开了一系列研究，并已取得可喜的进展，尤其是在低温调节基因表达的信号转导及转录调节方面有一些新的发现，对进一步阐明植物抗寒分子机制提供了新的实验依据，而且为提高农作物及园艺植物的抗寒力也提供了新的思路。1 植物抗冻蛋白及其抗寒机制
1.1 抗冻蛋白的理化性质 抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是20世纪60年代从极区海鱼的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效抗冻活性物质。之后，研究对象从极区鱼扩展到昆虫。植物AFP 的研究较晚，直到1992年加拿大Griffith 等[4]才第一次提出从植物中获得内生AFP 。这些抗冻蛋白都具有3个基本性质:(1)热滞效应，热滞是一种非理想溶液的行为，即溶液的冰点不由溶液的依数性决定，而其熔点却由溶液的依数性决定，从而呈非依数性地降低溶液的冰点;(2)冰晶形态效应，即冰晶形态的修饰;(3)抑制重结晶
[5]
。
1.2 抗冻蛋白的生理功能 植物AFP 在植物抗寒生理中可能有以下7个方面的作用:(1)降低原生质溶液的冰点;(2)抑制重结晶;(3)修饰胞外冰晶的生长形态;(4)降低冰晶的生长速度;(5)保护细胞膜系统;(6)阻止细胞内冰晶的形成;(7)调节原生质体的过冷状态[6,7]。此外，抗冻蛋白不仅有抗冻活性，还可能有抗冻和抗病双重功能，因为在冬黑麦及一些抗冻的谷类作物中发现了与内切B -1,3葡聚糖酶、内切几丁质酶、甜味蛋白等3类病原相关蛋白同源的抗冻蛋白[8,9]。但是有报道指出，在非低温条件下，感染了雪霉病的冬黑麦叶片质外体中可累积包括葡萄糖酶、几丁质酶和甜味蛋白等病原相关蛋白(PR)，而这些由病原体诱导的PR 蛋白并无抗冻能力。有趣的是，冷响应的冬黑麦PR 蛋白却表现出抗冻力及抗真菌的酶活性[10]。这一现象揭示PR 蛋白在冷驯化过程中可能通过编码该蛋白基因的演化及在低温下蛋白序列的化学修饰获得抗冻力。这种抗冻力的获得需要PR 蛋白至少作3个改变，一是修饰蛋白表面，使其具有一个束缚冰晶的结构域；二是蛋白应定位在质外体中，而非液泡中；三是在低温下诱导表达[11]。1.3 抗冻蛋白的基因工程 自1998年10月英国York 大学的Worrall 等[12]在Science 杂志上发表了胡萝卜AFP 及其基因的论文，即发现第一个植物AFP 基因以后，植物抗冻基因工程研究进入了一个新的里程。在此之前，人们研究AFP 基因工程
时采用的目的基因仅来源于鱼类，如黄永芬等[13]将美洲拟鲽AFP基因导入番茄中并获得成功，其转基因植株的抗寒力有提高。Worrall等[12]将胡萝卜AFP的cDNA连接在表达载体的双CaMV32S启动子
之后导入烟草，让其组成型表达，检测这些含有胡萝卜AFP的烟草提取物时，发现它们具有抑制冰晶生长的活性。几年来，人们又在冬麦草[14]、冬黑麦[11]中相继克隆到植物抗冻蛋白基因，这些无疑为植物抗冻基因工程研究开辟了新的途径。
1.4抗冻蛋白在植物抗寒中的作用机制AFP的抗冻机制在鱼类中研究比较多，在众多的抗冻机制假说中，以吸附抑制学说较为合理。这一学说认为AFP吸附在冰晶表面，通过Kelv in效应抑制冰晶的生长。其实验证据是:(1)分布系数(A)，溶液结冰时,AFP分布在冰相中较多，而非抗冻性溶质相对较少;(2)改变冰晶行为,AFP使冰晶生长成针形吸附于冰晶c轴表面，抑制a轴方向上的生长[7]。Achenbach和Ewart[15]发现胡瓜鱼的AFP属于Ò型抗冻蛋白(AFPÒ)，而且是一个二聚体，这不同于其它鱼类AFP的单聚体形式。AFPÒ被认为与C型凝集素同源，它们有结合碳水化合物和Ca2+的位点，与AFP结合冰晶有关。胡瓜鱼AFP的二聚作用虽然也与抗冻活性相关，却不需要结合碳水化合物和Ca2+。因此推测这种AFP有一种新的抑制冰晶生长的机制。
有关植物AFP的抗冻机制亦曾有过报道。费云标等[16]报道沙冬青及黑小麦AFP的冰晶[4]都具有鱼类AFP双锥形的冰晶形态，因此推测植物AFP与鱼类AFP可能有类似的作用机制，依靠抗冻蛋白的热滞效应降低冰点。但植物AFP的热滞效应大大低于鱼类和昆虫的AFP，这对环境温度远远低于- 1.9e下的北方越冬植物来说，仅靠AFP 的热滞效应来降低冰点是难以解释的。因此，植物AFP的作用除了降低冰点外，更重要的是还有降低过冷点和抑制重结晶等作用，这些作用比冰晶生长的抑制作用更易实
现。从沙冬青中分离的部分纯化的AFP比纯化的AFP活性高[16]，暗示植物中可能存在AFP的活化蛋白，或AFP与其它某些物质的相互作用均可增加AFP的活性。Baudo等[17]从马铃薯一野生品种中分离出一个低温和ABA应答基因的cDNA，该基因编码富含甘氨酸的RNA结合蛋白(SCRGP-1)，其氨基酸序列显示该蛋白含有一保守的RNA结合域，如一富含甘氨酸的羧基末端区域。其相应的基因可受低温、ABA、机械损伤和干旱诱导。Baudo等推测SCRGP-1蛋白可能参与增强抗冻的适应过程。但AFP单因子作用似乎还不能解释零下几十度的低温下一些强抗冻植物能照常存活的现象，这些说明植物的抗寒力乃是AFP与多种抗冻因子共同协调、综合作用的结果。近期我们在研究国外引进植物日本桃叶珊瑚抗寒分子机制时发现，低温下诱导产生的特异蛋白不止一个，与抗寒相关的蛋白可能也不止一个。我们还发现,4e低温驯化能大大提高植物的抗寒性，可使植物的半致死温度由-7e降至-24e。此外，低温下净光合速率明显下降，呼吸减弱，丙二醛和脯氨酸明显增加。这些也表明，引起抗冻作用的内在因子远不止一两个，可能是由一系列相关因子共同作用所致[18]。
2抗寒基因的表达调控
近年来的研究表明，除了一些组成型基因的表达具有抗寒作用外，植物经过抗寒锻炼，即冷驯化后，细胞内的基因表达即发生改变，一些潜在的与抗寒功能有关的基因也表达，抗寒基因mRNA转录体产生，合成新的抗寒蛋白质，从而提高植物的抗寒力[1]。迄今，已从抗寒模式植物拟南芥及其它农作物、园艺植物等多种植物中分离鉴定出不少受低温诱导表达的基因。其中，有些基因是冷诱导专一性
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基因，而有一些除对低温响应外，还能被ABA、干旱、高盐等胁迫所诱导，因此，研究者们认为抗寒作用与ABA、干旱、高盐逆境因子诱导的抗性具有共同的基因作用机制[19,20]。
2.1基因表达的信号转导
2.1.1钙与信号转导细胞内各种变化的产生是如何被低温所诱导的，还不完全清楚。但是，大量研究证明，钙作为第二信使在这些变化的早期活动中起一定的作用，低温能诱导植物细胞内Ca2+浓度的增高。应用钙螯合剂和离子载体的研究已经证明细胞质内钙离子浓度可调节低温诱导的核基因表达[2]。最近的研究发现，低温等环境因子不仅引起细胞质内Ca2+水平升高，而且还能引起细胞核内Ca2+浓度迅速增加[21,22]。这为分析Ca2+与冷响应基因表达的密切关系提供了新的证据。至于Ca2+输入后，信号如何传递，有学者认为是钙离
子结合蛋白(例如钙调蛋白)、依赖Ca2+的蛋白激酶和蛋白激酶C等触发了一系列的磷酸化作用，从而导致冷调基因的表达[23,24]。但低温感应器或接受器的问题依然存在。有学者根据一些低温响应基因的诱导依靠胞外钙离子流[25]的结果，推测低温感应接受器可能和质膜联系在一起。Ding和Pickard[26]推测，低温感应器可能是钙离子通道。最近有研究指出，小麦在低温响应过程中累积了两个分子量分别为39和22.5kD的膜联蛋白，它们在抗性强和抗性弱的小麦中累积程度相似，这种对低温响应的相似性表明这两种膜联蛋白的累积与抗冻不相关，而是植物对低温的一个普遍响应，通常与冷
驯化的第一个阶段联系在一起。已知膜联蛋白是钙和磷脂结合蛋白的大家族，它们通常被认为是依赖钙的可溶性磷脂结合蛋白。因此推测内在性膜联蛋白可能是作为低温触发的钙离子流的感应器或传导器，也可以作为胞内钙离子浓度的调节器而发挥作用[27]。
2.1.2ABA与信号转导大量研究表明,ABA参与植物低温响应，这表现在:(1)拟南芥经过低温处理(4e/2e)后，内源ABA增长3倍;(2)ABA可使生长在22e下的拟南芥植株抗冻力增强;(3)ABA 缺陷型突变株在低温处理下会受到冷的伤害;(4)对ABA不敏感型突变株施加ABA不能诱导冷驯化[28,29]。因此，有人对ABA在植物冷驯化过程中的信号转导提出一种模型，此模型包括位于在质膜上的ABA感受体及由ABA调节引起的胞液内Ga2+水平的增加[2]。Ishitani等[30]分析拟南芥突变株在低温胁迫响应中的信号转导途径指出，依赖ABA和不依赖ABA的信号转导途径并不是完全不相关的，而是存在着交叉转导作用。
2.1.3蛋白激酶与信号转导蛋白激酶在植物感受低温、干旱及高盐胁迫的一系列信号转导途径中起着重要作用[31]。最近从模式植物拟南芥中克隆了一些同时受低温、高盐、干旱诱导的蛋白激酶基因，分别编码受体蛋白激酶(RPK)、促分裂原活化蛋白激酶、核糖体蛋白激酶以及转录调控蛋白激酶，它们在植物胁迫信号的接受、转导及抗性基因表达调控等过程中起作用。一般认为第一类激酶在各种信号感受及传递中起作用，但是否引起有促分裂原活化蛋白(M AP)激酶级联反应参与的转导途径，还是直接作用于转导途径的下游传递体，还需实验验证；第二类激酶具有MAP激酶级联反应的功能，在不同的信号传递过程中起作用，但MAP 激酶级联途径的成员以及与其它信号传递途径的相互关系尚待确定；
第三类是位于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的下游，在胁迫诱导下激活核糖体S6，增加细胞内与这些胁迫耐性相关的蛋白质的合成，或作为细胞在逆境胁迫下的应激反应，促进所有蛋白质的合成；第四类激酶的功能目前尚不了解，可能位于信号传递的下游，作为拟南芥中转录复合物的重要组分在转录水平上调节多种基因的表达[32]。
2.1.4信号转导的其它可能途径最新的研究指出，低温条件下的冬小麦叶片中的硝酸还原酶活性既不依赖于由冷诱导的钙流，也不依赖于内源ABA水平，而是在转录水平上与蛋白磷酸酶的去磷酸作用相关。冬小麦叶片在低温(4e)处理后，叶片中的硝酸还原酶通过蛋白的去磷酸化而被激活[33]。已有证据表明，硝酸还原酶的去磷酸化作用是由蛋白磷酸酶2A(PP2A)所催化的，因此推测植物细胞中PP2A家族的一些成员不受冷诱导的钙离子流所调节[34]。相信进一步研究影响PP2A 的基因表达及活性因子的分离及其特征鉴定后，一种不依赖钙的低温信号转导途径可能即会弄清楚。另外,Xin和Brow[35]从拟南芥中鉴定了一种基因Esk1，它能影响脯氨酸和糖的水平，有提高植物抗寒力的作用，但此种Esk1的冷调节基因并不过量表达。因此他们推测,Esk1有另一种冷驯化转导途径，与其它冷诱导基因的传导途径不同。他们提出一种平行或分枝的信号转导途径模式。总之，迄今为止，还没发现一个完全独立的由低温诱导的信号转导途径，目前所观察到的途径或多或少地都与其它信号转导途径特别是那些由胁迫诱导的信号转导途径在某些方面相互作用。低温诱导信号转导途径的某些阶段也极可能对低温响应具有专一性，但还尚待进一步的研究。
2.2基因表达的转录调节及转录后的调节低温响应基因的表达有的是在转录水平上调节，有的是在转录后调节，还有的则是在转录和转录后两个水平上调节。对于这些冷诱导基因表达的研究主要是围绕模式植物拟南芥展开的，在拟南芥冷诱导基因的启动子区存在对寒冷及脱水胁迫应答的顺式作用调节元件CRT/DRE(C-repeat/dehydration-re-
sponsive elem ent)[36,37\<。这些CRT/DRE调节元件几乎都有一个保守的5个碱基对组成的核心序列CCGAC[38]。目前，已克隆了一些冷诱导基因启动区，但至今仍未克隆出真正的冷诱导基因启动子。这些启动区域内的调节元件CRT/DRE是如何被激活而启动基因表达的?研究者们从拟南芥中发现了与CRT/DRE结合的冷响应转录调节活化因子CBF1/DREB1b,CBF2/DREB1c,CBF3/ DREB1a，这些CBF活化因子都是含有AP2蛋白的DNA结合蛋白家族的成员。在非低温胁迫条件下,CBF1和CBF3在拟南芥中的过量表达可激活启动区内含CRT/DRE序列的冷诱导基因表达，并提高植物的抗寒力[20,39~42]。另有研究指出, CBF3表达的植株可以提高脯氨酸和总可溶性糖的水平，植物超表达CBF3可提高脯氨酸生物合成酶(P5CS)的转录水平，而脯氨酸水平的提高有一部分则是由于P5CS的表达增强之果。据此推测CBF3是综合调节着与冷驯化响应相关的多种组分而使之激活的。在调节过程中，它们的蛋白产物的作用可能更大，这些蛋白可能激活由温度调节的蛋白激酶的磷酸化作用，也可能受低温下植物生长停滞所造成的新陈代谢变化影响[43]。最近有人指出，油菜中有类似CBF的基因(CBF-like)，这些基因响应低温后快速转录，接着冷调节基因Bn115表达。Bn115是一种类似于拟南芥CBF靶基因Cor15balloon什么意思
a的同源基因，在转基因油菜中CBF的超表达可诱导拟南芥CBF靶基因的同源物表达，从而增强植物的抗寒性。在小麦、黑麦、番茄中也发现了这种类似CBF的蛋白，上述这些含有CBF或类似CBF的植物中都存在保守的氨基酸序列:PKK/ RPAGRxKFx ET RH P和DSAWR。这些序列有一个AP2/EREBP DNA结合结构域，因此推测,CBF 冷响应途径组分在开花植物中是高度保守的，并不仅仅局限那些经过冷驯化的植物[44]。
自从发现包含组蛋白乙酰转移酶(HAT)的连接复合体后，人们对转录调节机制有了新的认识。这个复合体通过转录活化因子成为启动子的一部分，认为它是通过特异组蛋白的乙酰化作用和使启动子更接近转录体的作用重建染色质[45~47]。在拟南芥中也发现有类似酵母中的Ada和SAGA复合体。Ada和SAGA复合体是由组蛋白乙酰转移酶(HAT)Gcn5、转录连接蛋白Ada2和Ada3三个关键因子组成。拟南芥中有Gcn5和Ada2基因的同源物,CBF1转录活化因子能够与GCN5和ADA2蛋白相互作用，因此推测拟南芥编码与酵母Ada和SAGA复合体相关的含HAT的连接复合体,CBF1通过与这种复合体的一个或多个因子的作用而实现转录激活[48]。
最近，在大豆中发现了一种新的锌指环蛋白(zinc finger protein)SCOF-1，编码该蛋白的基因已得到。SCOF-1受低温和ABA诱导，但不受脱水和高盐诱导，它在低温处理的拟南芥和烟草中的过量表达可诱导冷调节基因的表达，提高植物的抗寒力。SCOF-1位于核内，但并不直接与CRT/DRE 或ABA响应元件(ABRE)结合，它可通过增强SGBF-1(大豆的一个框结合碱性亮氨酸拉链型转录因子)与DNA启动
子区的顺式作用元件之间的结合力间接增强冷调节基因的表达和抗寒力[49]。
转录后调节机制的研究主要是以拟南芥中编码RNA结合蛋白的两个低温诱导基因cor1和cor2的分离[50]和大麦低温诱导基因blt801的分离[51]为材料进行的。这些基因编码有两个不同结构域的蛋白质，其氨基端结构域包括两个RNA结合蛋白(RNP1和RNP2)基序(motif)，它们和其它大量高度保守的氨基酸残基一样都有一个大约80个氨基酸的RNA结合区域(RRM)。羧基端结构域包括由精氨酸和酪氨酸隔开的重复甘氨酸序列。编码富含甘氨酸的RNA结合蛋白质(GR-RNPs)的植物胁迫诱导基因已有所报道，预测它们都能够编码RNA结合蛋白质，其中仅有3个证实具有核酸结合潜能，即玉米的MA16蛋白、烟草RGP-1b 蛋白及大麦Blt801蛋白。植物GR-RNPs的两个结构域与动物中异源核RNA结合蛋白的A1和A2/ B1基因有相似性，推测这些GR-RNPs在低温胁迫响应中参与转录的选择拼接[2]。
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由于植物抗寒性的提高是由多基因控制的，而且还与其他环境因子的胁迫发生交叉作用，这就增加了抗寒机制研究的复杂性。目前，这一领域的研究虽然已有了新的进展，但还存在着诸多问题亟待解决。
(1)鱼类抗冻基因编码的AFP的抗冻机制研究比较多，而植物AFP的抗冻作用机制研究比较少，就其主要理论机制)))吸附抑制学说来说,
展览的意思AFP吸附冰晶抑制生长的理论依据尚不完善。今后应从多种植物中提取AFP，并对它们的结构、功能进行鉴定、比较分析，这样方可有助于深入阐明AFP的抗冻机制。
(2)目前，还未发现一个完全由低温诱导的信号转导途径，已知道的途径多少与其它信号转导途径，特别是那些由胁迫诱导的信号转导途径，在某些环节上有交互作用。因此，设计和建立更好的实验系统，进一步分离、鉴定冷信号传递途径中的新成员，研究它们在传递途径中的相互作用，及与其它胁迫信号传递途径之间的关系，对进一步阐明植物抗寒机制是十分重要的。
(3)冷诱导基因表达的调节还有以下几个问题值得深入探讨:¹迄今仍未克隆出真正的冷诱导基因启动子;º是否是CBF基因家族的3名成员控制相同的基因序列，还不清楚，通过转基因拟南芥中CBF1、CBF2、CBF3三个转录因子及其靶基因的表达水平及相应植株生长发育的比较，可能对此问题的解决有所帮助;»拟南芥中发现的类似酵母ADA2和GCN5基因的同源物是否广泛参与冷诱导基因的表达，是否还有其它一些特殊的功能都尚不明了，在拟南芥中利用反义遗传方法鉴定它们的功能可能会得到部分解决;¼冷诱导基因转录后调节的研究进展不大，这可能与转录后蛋白质的翻译加工易受温度、蛋白质结构以及稳定性等多种因素影响有关。相信在不久的将来，随着对抗寒相关基因、蛋白的序列、立体结构和功能的进一步分析和研究，植物抗寒机制一定能有所突破。
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