不同方法检测鸡蛋表面菌落总数的相关性研究

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doi:10.3969/j.issn.1007 7146.2017.03.012
不同方法检测鸡蛋表面菌落总数的相关性研究
程教擘1,李梦丹1,2,刘 金1,2,谢艳华1,2,陈力力1,2 ,刘 焱1
,2
(1.湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙410128;2.食品科技和生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128)
摘 要:研究了ATP生物荧光检测法与国标法《GB4789.2 2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定》检测鸡
蛋壳表面细菌总数的相关性。采用ATP生物荧光检测法和国标法对40个混合样品表面细菌总数进行检测,以logCFU/个蛋壳为横坐标(x),以logRLU/个蛋壳为纵坐标(y),分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合。结果表明,
ATP荧光检测法与国标法检测结果Pearson相关系数为0.912,线性模型y=0.7306x-1.0041(R2
=0.8322)拟
合度较高。该试验结果为ATP荧光检测法在鸡蛋壳表面细菌总数快速检测中应用的可行性提供了依据。
关键词:蛋壳;ATP生物荧光法;细菌菌落总数;相关性中图分类号:TS253文献标识码:A
文章编号:1007 7146(2017)03 0260 06
AStudyontheCorrelationofDifferentMethodsforDetectingthe
TotalNumberofBacteriaontheSurfaceofEggs
CHENGJiaobo1,LIMengdan1,2,LIUJin1,2,XIEYanhua1,2,CHENLili1,2 ,LIUYan
1,2
(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAg
riculturalUniversity,Changsha410128,Hunan,China;2.HunanProvincialKeyLaboratoryofFoodScience
jenniferaniston
andBiotechnology,Changsha410128,Hunan,China)
Abstract:Inthisstudy,thebacterialcountoftheeggshellsurfacewascomparedbytwomethods:GB4789.2 2010
microbiologicalexaminationoffoodHygiene:detectionofaerobicbacterialcount,ATPbioluminescenceassaytostudythecorrelationbetweenATPcountandroutinebacterialdetection.Thetotalbacteriacountonthesurfaceof40mixedsampleswasdetectedbyATPfluorescencedetection,andthenationalstandardmethodwasusedasthecontrol.ThePearsoncorrelationcoefficientofATPfluorescencetestand
theresultofnationalstandardmethodwas0.912.Ontheba sisoftheseresults,withlog(CFU)asabscissa(x)andlog(RLU)asordinate(y),thelinearfitting,logarithmfitting
andexponentfittingwereconducted.Thefittingdegreelogarithmicmodely=0.7306x-1.0041(R2
=0.8322)was
higher.ATPfluorescencedetectionmethodandthenationalstandardmethodintheeggshellsurfacebacterialloadde tectionresultshaveagoodcorrelation.ATPfluorescencedetectioncanbereplacedtosomeextent,routinetestingofbacteriaandappliedtotheactualproduction.
Keywords:eggshell;ATPbioluminescencemethod;thetotalnumberofbacterialcolonies;correlation
第26卷第3期2017年6月          激 光 生 物 学 报ACTA LASER BIOLOGY SINICA
Vol.26No.3
Jun.2017收稿日期:2017 02 23;修回日期:2017 03 17
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201303084);湖南省自然科学基金(61275118)作者简介:程教擘(1997-),男,湖南衡阳人,本科生。(电子邮箱)4984144@qq.com
通讯作者:
陈力力(1962-),教授,博士,主要研究方向:食品生物技术。(电子邮箱)chenlili001281@sina.com;刘焱(1970-),教授,博士,主要研究方向:食品科学与工程。(电子邮箱)1356130766@qq.com
0 引言
菌落总数计数是判定食品被细菌污染程度的标志,既可了解食品中细菌的性质也可观察细菌在食品中
的繁殖动态,是进行食品卫生学评价时常规检测的指标,然而按照传统检测方法,食品待检测样品经过处理后,需在一定条件下培养36 48h,再通过计数和计算才能得到样品中所含细菌菌落总数(CFU/mg或CFU/mL),虽然该方法结果准确,但操作繁琐耗时长,并对检测环境、操作规范、稀释培养过程中的温度、pH等影响因素要求较严格,否则易造成杂菌污染,结果误差,难以满足食品企业实施HACCP体系实时监控的要求。
目前人们开展了与菌落总数计数相对应的快速检测方法的研究,如ATP生物荧光法、分光光度法、电阻抗法等[1 4],其中,ATP荧光检测法是利用“荧光素酶 荧光素体系”快速检测样品的三磷酸腺苷(ATP)达到检测目的的[5]。在有氧条件下,检测试剂中的荧光素酶催化荧光素与样品中的细菌ATP之间发生氧化反应形成氧化荧光素并发出荧光,荧光的强弱取决于ATP的数量,样品ATP量越高,发出的荧光也就越强,然后通过检测仪捕捉和检测发光值读出数据,通过相对荧光值和细菌细胞数的关系曲线来确定样品中的细菌数量[6 7]。与传统微生物检测方法相比,ATP荧光检测法的测试时间短,操作简便,能够快速检测微生物的含量[8 9]。近年来,有关利用ATP荧光快速检测法监控微生物以及表面清洁度的报道主要涉及医疗卫生行业,如人们将ATP(三磷酸腺苷)生物荧光法引入到诊室物体表面污染程度、医护人员手卫生质量、医疗机构器械及环境物体表面洁净度的检测[10 13],同时也利用ATP荧光快速检测法测定了医院厨房里器具表面的清洁度[14]。在食品及其食品生产原料实时检测中的应用鲜有报道。
模具培训
鸡蛋富含各类营养,是人类常食用的食品之一,为了保证鸡蛋的食品安全,延长货架期,人们进行鸡蛋表面去污除菌的洁蛋处理,生产过程中洁蛋除菌效果的检测方法要求快速简便准确,为此我们在本研究中采用《GB4789.2 2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定》、ATP生物荧光检测法对新鲜鸡蛋壳表面细菌数量进行测定,比较两种检测结果之间的相关性,探讨ATP生物荧光检测法快速检测新鲜鸡蛋壳表面菌落总数的可行性。1 材料与方法
doctor strange1.1 材料与试剂
参照2016年《兽药残留抽样检测技术操作要点》的抽样办法,从湖南长沙的养鸡场随机抽取新鲜鸡蛋作为试验材料,采集时戴无菌手套将抽取的每个样品蛋分别装入无菌塑料袋中,密封,编号,及时送回实验室。
PCA培养基从北京陆桥技术有限责任公司购买,ATP荧光检测采样棒从美国3M公司购买。1.2 仪器与设备
Clean traceATP荧光检测仪(美国3M公司);SW CJ 2D超净工作台(江苏通净净化有限公司);SPX 250B Z恒温培养箱(上海博讯实业有限公司);LDZX 50KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);SB5200超声波清洗机(上海新芝生物技术研究所)
1.3 试验方法
1.3.1 样液制备
向装有样品鸡蛋的无菌采样袋中加入100mL无菌生理盐水,将此采样袋置于超声波清洗器中处理50s,得到的即为10 2倍样品悬液。用1mL微量移液器吸取10 2样品悬液1mL,沿管壁注于盛有9mL稀释液的无菌试管中,振摇试管使其混合均匀,制成10 3样品悬液。按上述操作,制备10倍系列稀释样品悬液。每递增稀释一次,换用一次1mL无菌吸头。
1.3.2 国标法测定蛋壳表面细菌总数
选取稀释倍数为10 3、10 4、10 5的样品悬液,于超净工作台吸取1mL样品悬液于无菌平皿内,将冷却至40~45℃的熔化琼脂计数培养基倾注平皿,每平皿15~20mL,并转动平皿使其混合均匀,翻转平皿,使底向上,置37℃温箱内培养48h,观察并进行菌落计数。每个稀释度做三个平皿。
1.3.3 ATP生物荧光法测定ATP荧光值
分别将ATP拭子采样棒从试管抽出插入上述各待测样品混悬液中充分浸湿,此时取样量为100μL,随后将拭子插回试管,用拇指和中指捏住球管,从吸阀处折断。轻轻挤出球管内液体,并振摇试
管15次充分反应,立即将试管插入手持ATP荧光检测仪,进行检测,读数并记录ATP生物荧光值(RLU)。1.3.4 相关性分析方法
用MicrosoftExcel2010进行相关性分析。
第3期           程教擘等:不同方法检测鸡蛋表面菌落总数的相关性研究 
2 结果与分析
2.1 菌落总数对应的ATP荧光值
样品检测结果见表1,采用国标法检测的样品细菌总数对数值为4
.02logCFU/个蛋壳-6.72logCFU/
个蛋壳,ATP荧光法检测的荧光值对数值1.91logRLU/个蛋壳-3.77logRLU/个蛋壳,同时发现,随着菌落总数的降低,RLU值也在降低,在此范围内二者呈正相关关系。
2.2 菌落总数与ATP荧光值的不同拟合曲线
以logCFU/个蛋壳为横坐标(x),以logRLU/个蛋壳为纵坐标(
y),分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合。因为测定的荧光值值与菌落总数呈正相关关系,所以不采用多项式拟合。结果见图1,指数模型和乘幂模型曲线的相关系数在0.8以下,没有统计学意义;线性模型和对数模型拟合的相关系数较好,线性模型优于对数模型,其拟合的相关系数为0.8322。
2.3 Pearson相关性分析
由2.2分析结果可得,国标法检测的logCFU/个蛋壳与logRLU/个蛋壳的线性拟合度最高,适用于Pearson相关系数的计算条件。将菌落总数变量与RLU值变量取对数后进行相关性分析。分析结果表明,两种方法检测结果的Pearson相关系数为0.912,
通常情况下通过以下取值范围判断变量的相关强度:相关系数0.8 1.0极强相关;0.6 0.8强相关;0.4 0.6中等程度相关;0.2 0.4弱相关;0.0 0.2极弱相关或无相关。
结果表明两种方法检测结果极强相关,可以通过ATP荧光检测仪检测荧光值快速反映出鸡蛋壳表面细菌菌落总数。
3 讨论
ATP荧光检测法具有灵敏度高(10 15 10 18
mol/L)、
速度快(常规培养方法需要18 24h以上,而ATP只需要几分钟)、可行性高(微生物数量与微生物体内ATP有明确的相关性,通过检测ATP含量,可间接得出反应中微生物数量)、可操作性高(可在任何时间、
任何地点使用)的优点[15]
morninglight
。目前该方法已广泛应用于食品工业、医药、生物学等领域[
16]
。已有部分研究证明其可以在一定程度上代替细菌常规检测,如王美容等利用A
TP荧光仪和荧光素酶对部分医疗物品表面自然菌含量进行检测和评价,结果证明ATP荧光仪检测结果RLU读数单位与常规培养方法菌落形成单位具有一致性,利用生物荧光法可以快速检
测出物体表面含菌量[17]
;陆烨等利用ATP荧光法和
细菌计数法平行比较,分别检测模拟现场消毒和疫源地现场消毒物体表面消毒前、后细菌的残留量,
结果发现随着不同时间模拟现场和现场实
图1 A:线性模型;B:指数模型;C:对数模型;D:乘幂模型
Fig.1 A:Linearmodel;B:Exponentialmodel;C:Logarithmicmodel;D:Powermodel
262              激 光 生 物 学 报           第26卷
表1 不同样品菌落总数及荧光值
Tab.1 Thecorrespondinglog(RLU)valuesfordif ferentsample
样品编号菌落总数
(CFU/
个蛋壳)
菌落总数
(LogCFU/
个蛋壳)
荧光值
(LogRLU/
个蛋壳)
11.6×1044.202.1822.4×1044.382.2032.4×1044.382.2443.8×1044.582.6455.5×1044.742.1764.4×1044.642.6972.7×1044.431.9182.5×1044.402.3192.1×1044.322.03101.5×1044.182.08112.3×1066.363.77121.7×1044.231.96132.0×1044.303.34143.5×1055.543.30151.2×1055.082.79169.8×1055.993.53173.9×1044.592.57181.7×1066.232.93192.4×1044.383.02205.3×1066.723.68211.9×1044.282.25229.2×1044.962.46235.2×1044.722.15241.4×1044.132.35251
.1×1044.022.08262.2×1044.342.03271.1×1055.052.85283.3×1044.521.95295.1×1044.702.20301.6×1044.201.96312.4×1044.382.17324.6×1055.663.83335.0×1044.702.44342.2×1044.342.35352.2×1044.332.10363.3×1044.522.08375.6×1044.752.56384.5×1044.652.57395.8×1044.762.16404.7×1044.672.79验,自然菌被消毒剂作用后残留菌落数(CFU)值降低,RLU值逐渐降低。且残留细菌数的RLU理论值与实验测得的实际值比较,二者无显著性差异,说明ATP生物荧光法检测的RLU值反映实际菌量,证明了ATP生物荧光法可快速地测定疫源地物体表面消毒效果的微生物评价[18]。本研究选取ATP生物荧光法与国标法对样品鸡蛋壳表面微生物污染检测,进行比较分析发现在实际应用过程中两种方法具有良好的相关性,并可建立相关模型来间接推断出细菌菌落总数。在数据分析方面,李桂明等[19]认为菌落总数对数值与RLU值呈指数关系,在0.89 0.96之间。而本研究发现在4个模型中,菌落数对数值与荧光值对数值线性相关性较高,这与刘俊江等[20]认为菌落总数对数值与发光强度对数值呈线性关系:y=0.61032x+0.07459(R2=0.96073)一致。进一步对比发现本研究中的菌落数集中在104 106,而李桂明等[5]构建的是梯度稀释模型,菌落数跨度从102 1013,这从侧面证明在不同范围内菌落总数与荧光值的拟合度最高的模型是不同的。因此,在实际生产过程中应根据食品表面微生物污染状况选择不同的菌落总数与发光强度拟合模型进行产品卫生监测。
  本试验说明鸡蛋是一种适合使用ATP荧光检测法检测表面细菌总数的样品,ATP荧光检测法能够准确有效地反映出鸡蛋表面卫生状况。但ATP荧光法应用于食品检测存在的首要问题是灵敏度有时达不到卫生学要求,从灵敏角度讲,ATP生物荧光法要求样品中细菌浓度最低不少于1000个/mL,这种灵敏度有时达不到卫生学要求[21]。另外食品中所含动物和植物的体细胞游离出的ATP对测定结果会产生干扰,食品中其他成分,如盐分、食品的酸度、离子强度等也可能对ATP测定有干扰。食品样品中细菌种类繁多,食品在加工、储存运输、销售等环节中微生物受到损伤如冷冻,高压灭菌后的体积变化、冷饮样品的解冻方式、样品稀释后的放置时间等均会影响ATP测定的准确性[22]。提高ATP生物荧光法检测的灵敏度可从两方面入手,一个方面是建立简便、有效的微生物细胞ATP释放方法,在温和的条件下将微生物细胞ATP从胞内释放出来,提高ATP释放剂的效果,并消除ATP释放剂对发光反应系统的抑制作用,提高检测灵敏度。目前微生物ATP释放方法主要有煮沸缓冲液法、酸提取法、有机溶剂提取法、表面活性剂法等。各方法均有利弊,在实际操作comment是什么意思
blend3
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过程中可通过试验比较各种ATP释放剂释放效果,筛选、组合出理想的微生物细胞ATP释放剂;通过正交试验选取ATP释放剂释放的最佳条件;通过优化试验,建立ATP释放剂对发光反应系统抑制作用消除的方法。另一方面,可以采用过滤法和前培养法并用加大检测样品菌体浓度的方法提高灵敏度。如利用减压过滤细菌富集装置,不但能富集样品中的细菌,且过滤可除去样品中的酶抑制剂及发光干扰剂。对于含固体成分较多且活菌较少的样品,可进行短时间的前培养,使细菌增殖到可以进行ATP测定的程度。在本试验中,影响荧光值的蛋壳表面其他污染物可能是鸡蛋表面固有的黏液层和鸡蛋经泄殖腔产出时附带的排泄物,它们成分复杂,可能影响荧光素酶 荧光素体系,进一步研究需进行样品预处理排除干扰物。
ATP生物荧光检测法尚不能完全取代常规菌落计数法进行食品卫生学监测,常规菌落计数是国家食品卫生技术规定的标准方法,此方法使细菌能在普通营养琼脂培养基上生长成肉眼可见的菌落,并易于后续的分离、鉴定。ATP检测法较为昂贵的检测费用以及不能鉴别细菌和有机物的不足,使其并不适于大量常规样本的检测,而更加适用于随机样本的抽查以及对食品清洁方法或生产程序改进进行评价。
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