Advances in Microbiology 微生物前沿, 2020, 9(4), 141-155
Published Online December 2020 in Hans. /journal/amb
/10.12677/amb.2020.94020
微生物卤化酶及其应用研究进展
郑哲麟，胡文达，何亚文*
上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，教育部代谢与发育科学国际合作联合实验室，上海twenty twelve
收稿日期：2020年11月15日；录用日期：2020年12月3日；发布日期：2020年12月10日
摘要
由于卤素原子具有强大的电负性，它的存在可以改变化合物的物理化学性质和生物活性。尽管我们可以通过化学反应合成卤化物，但能量消耗大，易对环境造成污染。许多天然化合物含有卤素原子，自然界演化出多种卤化酶来负责这些化合物的卤化。本文综述了目前发现的各种卤化酶及其特征以及催化机理，简介了如何通过人工改造拓宽卤化酶的催化底物和提高其热稳定性两方面的研究进展，为进一步促进卤化酶在工业催化方面的应用提供理论依据。
关键词
卤化物生物合成，卤过氧化物酶，α-酮戊二酸依赖型卤化酶，黄素依赖型卤化酶，
S-腺苷甲硫氨酸依赖性氟化酶
Rearch Progress in Microbial Halogenas and Their Industrial Applications
Zhelin Zheng, Wenda Hu, Yawen He*
State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Rearch Laboratory of Metabolic andayn
Developmental Sciences, School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai
Received: Nov. 15th, 2020; accepted: Dec. 3rd, 2020; published: Dec. 10th, 2020
Abstract
As the halogens have a large electronegativity, the introduction of a halogen atom to small mole-*通讯作者。
郑哲麟等
王庆根cules can have a profound effect on their bioactivity, physical and chemical properties. Halides can b
e synthesized through chemical reactions, which require high energy consumption and result in environmental pollution. Many natural compounds contain halogen atoms, and a range of haloge-nas have been identified to be responsible for the halogenation. In this review, the microbial halogenas identified and their characteristics and catalytic mechanisms were first introduced.
The current strategies to broaden the catalytic substrates of halogenas and to improve the ther-mal stability were then summarized. The information provides clues for the development of highly efficient halogenas in industrial catalysis.
Keywords
Biosynthesis of Halogenated Compounds, Haloperoxidas,世界杯西班牙夺冠
α-Ketoglutarate-Dependent Halogenas, Flavin-Dependent Halogenas,
S-Adenosylmethionine-Dependent Fluorinas Array Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licend under the Creative Commons Attribution International Licen (CC BY 4.0).
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1. 引言
卤素原子广泛存在于各类天然产物以及化工产品中。由于卤素原子具有强大的电负性，它的存在可以提高化合物的生物活性，改变化合物的物理化学性质，因此，卤族元素在药物、农药和新型材料中得以广泛的应用。部分临床药物氯霉素、万古霉素和瑞贝卡霉素含有卤素原子[1][2][3][4]；杀虫剂蚍虫啉和噻虫嗪、除草剂乙草胺和莠去津也含有卤素原子[5][6]；许多具有优良性能的有机聚合物都含有卤素原子[7][8]。因此，卤化物正受到科学界和工业界的广泛关注。
上个世纪，卤化有机化合物主要是通过化学方法合成，这种卤化方式导致了额外的能量消耗和极大的环境污染。随着天然卤化物生物合成途径研究的深入，其生物合成途径中的各种卤化酶给科学家们带来了新的思路。目前已经发现的卤化酶按照其作用机制和辅酶(辅基)主要分为四种类型：卤过氧化物酶(haloperoxidas, HPO)、α-酮戊二酸依赖型卤化酶(α-ketoglutarate-dependent halogenas, KG-Hal)、黄素依赖型卤化酶(flavin-dependent halogenas, F-Hal)和S-腺苷甲硫氨酸依赖性氟化酶(S-adenosylmethionine- dependent fluorinas) (图1) [9]。大部分卤化酶是以氯、溴或碘作为卤素供体，以氯最为常见，只有S-腺苷甲硫氨酸依赖性卤化酶是氟化酶，只以氟元素作为卤素供体。
本领域已有多篇综述介绍了卤化酶的特征[9][10][11]，在此基础上，本文结合最新研究成果，系统简介
卤化酶的分类、作用机制和应用研究进展，以飨读者。
2. HPO
HPO是最早被发现和鉴定的一类天然卤化酶，它利用过氧化氢使卤素阴离子氧化产生次卤酸作为卤化剂，与底物发生卤化反应。HPO可以利用氯、溴和碘元素进行卤化反应，不能与氟元素发生反应，因此，HPO可以分为氯过氧化物酶(chloroperoxida, CPO)、溴过氧化物酶(bromoperoxida, BPO)和碘过氧化物酶(iodoperoxida, IPO)。其中，CPO可以利用氯、溴和碘进行卤化反应，而BPO只能利用溴和碘，不能利用氯化物。按照参与反应的辅基，卤过氧化物酶主要分成血红素依赖型卤过氧化物酶(heme-iron-dependent haloperoxidas, Heme-HPO)和钒依赖型卤过氧化物酶(vanadium-dependent halope-roxidas, V-HPO)。
郑哲麟等
英语四六级开始报名Figure 1. Overview and classification of microbial halogena [9]
图1.微生物卤化酶概况与分类[9]
2.1. Heme-HPO
第一个Heme-HPO来自于海洋真菌Caldariomyces fumago，参与卡尔里霉素(caldariomycin)生物合成。它是一种糖基化修饰酶，由8个α-螺旋组成独特的三级结构，含有血红素辅基，氯化1，3-环戊二烯形成卡尔里霉素[12]。此外，该酶还具有过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素P450活性[12]。Heme-HPO的催化循环起始于血红素铁与水分子结合，随后被过氧化氢取代生成Fe(III)复合物。在催化位点的谷氨酸(Glu183)的作用下，导致O-O键断裂，Fe(III)复合物失去羟基形成Fe(IV)-OXO复合物。卤素离子和复合物结合，以次卤酸的形式释放，使底物卤化[13][14]。Heme-HPO缺乏底物选择性(substrate lectivity)和区域选择性(regiolectivity)，可能产生自由扩散的次卤酸，与许多易受亲电攻击的底物发生反应(图2) [15] [16]。
2.2. V-HPO
V-HPO主要存在于海洋生物海绵、红藻等[17]，但在地衣、真菌和细菌中也有发现[18][19]。整个V-HPO呈双锥形，与酸性磷酸酶的结构高度相似。在催化循环的最初阶段，钒离子含有四个氧配位位点，
specialforces
剩余的一个配位位点被组氨酸残基占据。在过氧化氢的存在下，过氧化氢与钒离子的最远端氧配体结合，失去一分子羟基，导致环氧化物中间体的形成。卤素离子进攻环氧基团，导致次卤酸的形成。游离的次卤酸攻击底物完成卤化反应(图3) [20][21]。
大部分V-HPO无法特异性地选择底物，仅少部分V-HPO具有底物特异选择性。首次报道的具有底物选择性的V-HPO是珊瑚藻(Corallina officinalis)中的溴过氧化物酶V-BPO，负责倍半萜类物质的非对映性溴化和环化反应，催化倍半萜类物质 e (E)-(+)-nerolidol生成α-snyderol，β-snyderol和(+)-3β-bromo- 8-epicaparrapi oxide [22]。此外，链霉菌(Streptomyces) spQ-525中鉴定并体外表达的钒依赖型卤过氧化物酶NapH1具有高度的底物选择性，参与napyradiomycin的生物合成，负责萜类化合物SF2415B1氯化生成SF2415B3 [23]。链霉菌sp. CNH-121中的钒依赖型氯过氧化物酶Mcl24特异催化merochlorin前体氯化生成merochlorin-A和merochlorin-B。
郑哲麟 等
Figure 2. Catalytic cycle of Heme-HPO [10]. In the resting state, water is bound to the heme-iron, which is subquently re-placed by hydrogen peroxide. After protonation of this complex by a catalytic glutamate (Glu183), water is eliminated creat-ing the actual active species, the Fe(IV)-oxo complex. A halide, in this ca chloride, binds to the Fe(IV)-oxo species and is relead as hypochloric acid, regenerating the heme-site by hydrolysis with water
图2. Heme-HPO 的催化循环[10]。在起始状态时，水与血红素铁结合。随后水被过氧化氢取代，生成Fe(III)-OOH 复合物。通过催化谷氨酸(Glu183)质子化该复合物后，形成Fe(IV)-oxo 复合物。之后，氯离子与Fe(IV)-oxo 复合物结合，释放游离的次氯酸，并通过水的水解再生血红素铁
Figure 3. Catalytic cycle of V-HPO [10]. In its resting state, vanadium contains four oxygen ligands, while the free coordi-nation site is occupied by a catalytic histidine residue. In prence of hydrogen peroxide, a hydroxyl group is substituted by peroxide. Upon elimination of a hydroxide ion, a cycloperoxo-species is generated, which is stabilized by a catalytic lysine residue. This cyclic intermediate is opened by addition of a halide, in this ca bromide, which can then be hydrolyzed by water, leading to the relea of hypobromic acid. During catalysis, the vanadium does not alter its oxidation state (V)
图3. V-HPO 的催化循环[10]。在起始状态，钒含有四个氧配体，而自由配位位点被催化组氨酸残基占据。在过氧化氢作用下，一个羟基被过氧化物取代。在去除一份子氢氧化物离子后，产生环过氧化物中间体。接下来，卤素原子进攻环过氧化物中间体，之后被水分子水解，释放出次卤酸。在催化过程中，钒不会改变其氧化状态
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郑哲麟等
虽然HPO能催化许多化合物产生卤化反应，但要么像Heme-HPO一样不具有底物特异性，要么像部分V-HPO一样具有高度的底物特异性和狭窄的底物谱，因此，HPO难以作为良好的生物催化剂在工业生产中得到广泛的应用。
3. KG-Hal
simultaneouslyKG-Hal是依赖于α-酮戊二酸和非血红素铁的一类卤化酶，将卤素原子装配到未活化的SP3-型杂化碳原子中心，具有一定的底物选择性和区域选择性[24]。首次发现的KG-Hal是丁香假单胞菌(Pudomonas syringae)中的SyrB2，参与非核糖体肽Syringomycin E的生物合成。SyrB2无法卤化游离的L-亮氨酸，L-亮氨酸必须与肽基载体蛋白(peptidyl carrier proteins, PCP)结合才能完成卤化反应。体外酶活测定发现只有环境中存在Fe(II)、O2和Cl−时，SyrB2才有氯化活性[25]。SyrB2的核心由八个反平行的β-折叠‘jelly-roll’模体组成，核心铁蛋白存在两个组氨酸配体。在催化起始状态时，α-酮戊二
酸、氯离子和水分子与催化中心的Fe(II)结合，底物进入活性位点将水分子除去并诱导氧气结合。此后，α-KG脱羧导致高能的Fe(IV)- oxo中间体形成，并从底物中夺去一个氢原子。氯原子进攻底物的自由基，使底物氯化并再生Fe(II)中心(图4) [26]。
Figure 4.Catalytic cycle of KG-Hal [9]. In its resting state, α-KG, chloride ions and water molecules
combine with Fe(II) in the catalytic center, and subquently the substrate enters the active site to remove
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a molecule of water and combine with oxygen. After that, α-KG removes one molecule of carboxyl group
to form Fe(IV)-oxo intermediate, and takes away one hydrogen atom of the substrate. Finally, the halogen
atoms attack the substrate, chlorinating the substrate and regenerating the Fe(II) center欢乐时光英文
图4.KG-Hal的催化循环[9]。在起始状态时，α-KG、氯离子和水分子与催化中心的Fe(II)结合，然
后底物进入活性位点，去除一分子水并与氧气结合。此后，α-KG脱去一分子羧基，形成Fe(IV)-oxo
中间体，并夺去底物的一个氢原子。最后卤素原子进攻底物，使底物氯化并再生Fe(II)中心除了催化与载体蛋白结合的底物，KG-Hal也能卤化独立底物。WelO5是第一个被鉴定可以卤化游离底物的酶，也是第一个能将卤素原子安装到非活化碳原子上的卤化酶，它参与Welwitindolinone生物合成，负责12-epi-Fischerindole U和12-epi-Hapalindole C中脂肪链上碳原子的氯化[27][28]。BesD是第一个发现的卤化游离氨基酸的KG-Hal，与SyrB2和WelO5的基因同源性较低，负责氯化游离的赖氨酸产生4-Cl-赖氨酸[29]。此外，在马杜拉放线菌(Actinomadura) sp. ATCC 39365的adeadecin生物合成途径中发现的第一个α-酮戊二酸依赖型核苷类卤化酶AdeV，能分别卤化游离的核苷类物质2'-dAMP、
2',3'-ddAMP或2'-dIMP，分别生成2'-Cl-2'-dAMP、2'-Cl-2',3'-ddAMP或2'-Cl-2'-Dimp [30]。
