***************世界华人消化杂志2010年1月18日; 18(2): 125-131
ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
基础研究 BASIC RESEARCH
DEN诱导大鼠肝癌形成中miR-199a的表达机制及健脾解毒法的干预作用
张 斌, 李 琦, 殷佩浩, 赵成根, 李先茜, 高 虹, 孙 珏, 范忠泽
张斌, 李琦, 殷佩浩, 赵成根, 李先茜, 高虹, 孙珏, 范忠泽, 上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科 上海市 200062
张斌, 博士, 副主任医师, 主要从事肝病的基础和临床研究.
中国博士后基金资助项目, No. 20080440639
肝肾疾病病证教育部重点实验室(上海中医药大学)开放课题基金资助项目, No. GS090203
作者贡献分布: 此课题由张斌、李琦及范忠泽共同设计; 研究过程由张斌、赵成根及李先茜操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由高虹与孙珏提供; 数据分析由张斌完成; 本论文写作由张斌与殷佩浩完成.
六级听力在线练习
通讯作者: 范忠泽, 主任医师, 博士生导师, 200062, 上海市兰溪路164号, 上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科.
********************
电话*************-4310
收稿日期: 2009-11-15 修回日期: 2009-12-10
余悸什么意思
接受日期: 2009-12-14 在线出版日期: 2010-01-18
Involvement of miR-
199a downregulation in
the preventive effects of
Jianpi Jiedu Recipe against experimental hepatocarcinoma in rats
Bin Zhang, Qi Li, Pei-Hao Yin, Cheng-Gen Zhao,
Xian-Qian Li, Hong Gao, Jue Sun, Zhong-Ze Fan
Bin Zhang, Qi Li, Pei-Hao Yin, Cheng-Gen Zhao, Xian-Qian Li, Hong Gao, Jue Sun, Zhong-Ze Fan, Department of TCM Oncology, Putuo District Center Hospital, Shang-hai University of Traditional Chine Medicine, Shanghai 200062, China
Supported by: the China Postdoctoral Science Foundation, No. 20080440639; and the Open Project Program Foun-dation of Key Laboratory of Liver and Kidney Dias (Shanghai University of Traditional Chine Medicine), Ministry of Education, No. GS090203 Correspondence to: Zhong-Ze Fan, Department of TCM Oncology, Putuo District Center Hospital, Shanghai Uni-versity of Traditional Chine Medicine, 164 Lanxi Road, Shanghai200062,************************** Received: 2009-11-15 Revid: 2009-12-10 Accepted: 2009-12-14 Published online: 2010-01-18
Abstract
AIM:To investigate the preventive effects of Jianpi Jiedu Recipe against diethylnitrosamine-induced hepatocarcinoma in rats and explore the involvement of miR-199a downregulation in this process.
METHODS: Male Wistar rats were randomly divided into three groups: normal control group (n = 25), model group (n = 40 ) and prevention group (n= 40). The normal control group was given normal saline [10 mL/(kg•d) ig] for 12 weeks, the model group was given diethylnitro-samine dissolve
d in drinking water (80 ppm) at a do of 8 mg/(kg•d) for the same duration, and the prevention group was given both dieth-ylnitrosamine at the same do and Jianpi Jiedu Recipe [17.5 g/(kg•d), ig] for the same duration. Five rats in each group were executed at weeks 4, 8, 12 and 16, respectively, and the remaining rats were killed at week 20. Meanwhile, the mor-tality, incidence of ascites, and liver and spleen index were measured. Hematoxylin-eosin stain-ing (HE) was ud to examine hepatic pathologi-cal changes. The expression of miR-199a mRNA was detected by real-time rever transcription-polymera chain reaction (RT-PCR).
RESULTS: At week 20, the mortality rate and the incidence rate of ascites were 0% and 0% in the normal control group, 42.5% and 87.5% in the model group, and 17.5% and 44.4% in the pre-vention group, respectively. The mortality rate and the incidence of ascites were significantly lower in the prevention group than in the model group (both P < 0.05). At week 16, the incidence of HCC was 100% in both the model group and prevention group and 0% in the normal control group, the incidence of grade III liver cancer was 100% (5/5) in the model group, and the inci-dences of grade I, II and III liver cancer were 40% (2/5), 40% (2/5 ) and 20% (1/5) in the prevention group, respectively. Compared with the model group, the liver and spleen index in the preven-tion group were significantly reduced at all time points (all P< 0.01). Real-time RT-PCR results showed that the expre
ssion of miR-199a was significantly upregulated in the model group. However, miR-199a expression was significantly downregulated in the prevention group at all time points except at week 16 (all P < 0.01).
CONCLUSION: Jianpi Jiedu Recipe has good preventive effects against hepatocarcinoma in
®
■背景资料
原发性肝癌是发
病率较高的恶性
肿瘤, 缺乏理想的
早期诊断和治疗
手段, 许多患者一
旦发现往往就是
晚期, 给进一步治
疗带来很大的难
度, 造成许多患者
从确诊到死亡的
时间很短, 因而加
研究生考试时间安排
强肝癌的预防就
显得尤为重要, 其
中中医药预防肿
瘤的作用受到越
来越多人的重视.
■同行评议者
丁惠国，主任医
师, 首都医科大学
附属北京佑安医
初中英语被动语态院肝病消化科
rats perhaps partly by downregulating miR-199a expression.
Key Words: Jianpi Jiedu Recipe; Primary liver can-cer; Diethylnitrosamine; Rat; Prevention; miRNA
Zhang B, Li Q, Yin PH, Zhao CG, Li XQ, Gao H, Sun J, Fan ZZ. Involvement of miR-199a downregulation in the preventive effects of Jianpi Jiedu Recipe against experimental hepatocarcinoma in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(2): 125-131
摘要
目的: 探讨中药复方健脾解毒方对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌的预防作用及其调控miR-199a 的表达机制.
方法: ♂Wistar 大鼠, 随机分为正常组(n = 25)、模型组(n = 40)及中药预防组(n = 40). 除正常组外, 其他组在1-12 wk 饮用含DEN 80 mg/L 的饮水[mg/(kg•d)]以诱癌, 中药组同时给予含生药1.75 g/mL 的健脾解毒方灌胃(10 mL/kg), 正常组给予10 mL/kg 生理盐水灌胃, 每日1次, 共12 wk. 于4、8、12、16 wk 时相点, 各组随机取5只大鼠处死取肝, 20 wk 将剩余大鼠全部处死取肝, 观察肝脏外观, 计算死亡率和腹水生成率, 比较肝脾指数, 肝组织进行HE 染色, 应用Real-time PCR 检测肝组织miR-199a 的表达. 结果: 在20 wk 实验结束时, 正常大鼠无死亡, 而模型大鼠死亡率为42.5%(17/40), 预防组死亡率为17.5%(7/40), 16-20 wk 时模型组腹水发生率为87.5%(7/8), 预防组为44.4%(8/18), 与模型组有差异性(P <0.05). 正常组没有肿瘤形成, 模型组和预防组在16 w k 后成瘤率均为100%. 16 wk 模型组肝癌Ⅲ级发生率为100%(5/5), 而预防组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肝癌发生率分别为40%(2/5)、40%(2/5)及20%(1/5), 两组比较有差异(P <0.05). 与模型组比较, 中药预防组有显著降低肝脾指数的作用(均P <0.01). PCR 结果显示, 模型组肝组织miR-199a 较正常组明显上调, 中药预防组除16 wk 外均有显著下调m i R-199a 表达的作用(均P <0.01).
结论: 健脾解毒方有预防DEN 诱导大鼠肝癌发生的作用, 其机制可能部分与下调miR-199a 的表达有关.
关键词: 健脾解毒方; 原发性肝癌; 二乙基亚硝胺; 大鼠; 预防; 微RNA
张斌, 李琦, 殷佩浩, 赵成根, 李先茜, 高虹, 孙珏, 范忠泽. DEN 诱导大鼠肝癌形成中miR-199a的表达机制及健脾解毒法的干
126 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2010年1月18日 第18卷 第2期
预作用. 世界华人消化杂志 2010; 18(2): 125-131
/1009-3079/18/125.asp
0 引言
原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国发病率较高的恶性肿瘤, 许多患者早期发病往往缺乏临床症状, 一旦发现常是晚期, 给进一步治疗带来很大难度, 造成许多患者从确诊到死亡的时间很短[1-5], 因而加强肝癌的预防就显得尤为重要, 其中中医药预防肿瘤的作用受到越来越多人的重视. 健脾解毒方为我院范忠泽教授的经验方, 既往研究发现该方具有提高机体免疫、改善脏器功能及抗消化系肿瘤等多种疗效[6-8], 但对其机制还不清楚. Micro RNAs(miRNAs)是小片段非编码RNA, 参与调节基因表达, 发现其表达失调与肿瘤发病密切相关, 具有癌基因或抑癌基因的特点, 是肿瘤诊断和治疗的重要靶点, 其中m i R-199a 与恶性肿瘤的发病关系近年来引起许多学者的高度重视[9-11]. 为此, 我们采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱发大鼠肝癌模型, 动态观察诱癌过程中肝组织miR-199a 的表达规律, 同时研究健脾解毒方对肝癌发病的预防作用及机制. 1 材料和方法
1.1 材料 0.95 g/mL 二乙基亚硝胺, 纯度99.9%, 美国Sigma 公司产品. TRIzol RNA 提取试剂, RT-PCR 试剂, Promega 公司; 健脾解毒方由生黄芪、白术、猪苓、八月札、石见穿、野葡萄藤、薏苡仁等组成, 经水煎、浓缩及醇沉制成, 制成含生药1.75 g/mL 浓度的中药制剂, 高压灭菌, 4 ℃存放备用, 由上海中医药大学附属普陀医院制剂室制成. ♂Wistar 大鼠105只, 清洁级, 体质量100 g ±10 g, 动物合格证号: SCXP(沪)2008- 0016, 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司, 所有大鼠分笼饲养于上海中医药大学附属普陀医院实验动物房.1.2 方法
1.2.1 造模及分组: 所有大鼠分笼饲养, 每笼5-6只, 适应性饲养1 wk 后, 全部大鼠分为正常组(n = 25)、模型组(n = 40)及中药预防组(n = 40): 模型组和预防组饮用含DEN 80 mg/L 的饮水, 维持DEN 摄入量8 mg/(kg·d)以诱癌, 并以普通灭菌水补足不足水量, 连续12 wk 后改为自由饮水; 中药组在饮用DEN 水的同时每日给予含生药1.75
■研发前沿
miRNAs 的表达失调与肿瘤发病密切相关, 具有癌基因或抑癌基因的特点, 是肿瘤诊断和治疗的重要靶点, 近年来, miR-199a 与恶性肿瘤的发病关系引起许多学者的高度重视, 同时健脾解毒方预防肝癌作用是否与调控miR-199a 有关, 这些都是目前亟待解决的课题.
张斌, 等. DEN诱导大鼠肝癌形成中miR-199a的表达机制及健脾解毒法的干预作用 127
g/mL 的中药汤剂灌胃(10 mL/kg), 每天1次, 正常组给予生理盐水10 mL/kg 灌胃, 每天1次, 连续12 wk. 于4、8、12、16 wk, 各组随机取5只大鼠处死取肝, 20 wk 时剩余大鼠全部处死取肝, 大体观察暴露肝脏, 记录肝脏的形态、颜色、质地, 记录一般情况及表面癌结节数, 记录腹水形成情况及计算肝脾指数.
1.2.2 大鼠肝脏超声波观察: 大鼠吸入含有2%异氟烷的氧气麻醉, 腹部用脱毛霜去毛. 凝胶外涂于小鼠脱毛的皮肤, 通过腹壁获取肝脏和邻近结构的冠状面和矢状面图像. 超声成像应用Vero 770TM Imagine System 型超声仪, 15L8W 宽频线阵探头, 频率为8.0-13.0 MHz.
1.2.3 肝组织病理学观察: 取肝脏标本, 40 g/L 多聚甲醛缓冲液固定24 h, 常规石蜡包埋, 切片, HE 染色, 光学显微镜下观察, 并对肿瘤采用Edmondson 分级法进行分级.
1.2.4 Real-time PCR 检测肝组织miR-199a 的表达水平: 提取各组组织总RNA, 进行PCR 检测m i R-199a 的表达, 每个样品测3次. 检测步骤: 样本各取1 μg 总RNA 作为逆转录模板, RT 引物为5'-CCCAGGCTGTCATATCGGTC-3', 同时设计扩增用mi R-199a 上游引物: 5'-A C C TCCCTGATTGGCTACGA-3', 下游引物: 5'- AGCCCTCTTTGATGCTGTCC-3'; 以U6为内参对照, 上游引物: 5'-TAAAATCTATATACACGAC GGCTTCG-3'; 下游引物: 5'-TACTGTGCGTTTA AGCACTTCGC-3', 把加好样品的96孔板放在荧光定量PCR 仪中进行反应, 反应条件如下: 95 ℃ 15 min 后连续45个循环, 每个循环内95 ℃ 15 s 、55 ℃ 30 s 、72 ℃ 34 s, 总反应体积20 μL, 反应结束后分析PCR 反应曲
线, 得到Ct 值. Real-time 分析采用2-ΔΔCt 法进行, 该方法是目的基因与内参基因的Ct 值比较, 即ΔCt = Ct 目的基因-Ct 内参基因, 再将实验组与对照组比较, 即ΔΔCt = ΔCt 实验组-ΔCt 对照组, 相对表达量 = 2-ΔΔCt 进行计算.
统计学处理 所有数据采用SPSS11.0软件统
计分析, 计量资料以mean ±SD 表示, 采用单因素方差分析, 计数资料的统计采用卡方检验, 肿瘤分级发生率比较采用两样本秩和检验, 两组间均数比较采用t 检验, P <0.05为差异有统计学意义.2 结果
2.1 大鼠一般情况及成瘤率 正常组大鼠生长状态良好, 体质量增加显著, 皮毛光滑, 二便如常; 模型组活动少, 精神萎靡, 胡须下垂, 喜睡少动, 体质量增加减少, 皮毛欠光滑, 尿色黄, 有腹泻; 中药预防组一般状态明显好于模型组. 在20 wk 实验结束时, 正常大鼠无死亡, 而模型大鼠死亡率为42.5%(17/40), 预防组死亡率为17.5%(7/40), 经解剖发现, 正常大鼠无腹水, 模型组和预防组在16-20 wk 时部分出现腹水, 去除病死部分, 经16、20 wk 解剖后统计, 模型组腹水发生率为87.5%(7/8), 预防组为44.4%(8/18), 预防组与模型组的死亡率和腹水发生率比较均有差异性(均
6年级数学补习P <0.05). 正常组没有发现肿瘤形成, 模型组和预防组大鼠早期肝脏表面变粗糙, 质地较柔软, 边缘锐薄, 切面呈斑剥状, 诱癌至12 wk 肝脏表面和实质内出现大小不等的结节, 直径<1 cm, 质地变硬, 16 wk 后结节变硬, 个别直径>2.5 cm, 有结节型、巨块型和弥漫型, 模型组和预防组在16 wk 后成瘤率为100%.
图1显示模型组和预防组在16 wk 时采用超声波均可探及肿瘤形成, 表现为圆形或类圆形略高、等或低回声结节, 无包膜, 边界清楚, 有较明显的声晕, 内部回声欠均匀, 当肿瘤内部出现坏死时可呈低或无回声.2.2 病理形态学观察
2.2.1 肉眼观察: 正常组的大鼠肝脏表面光滑, 色淡红, 边缘锐利, 质地软(图2A). 模型组和预防组大鼠随着诱癌过程的进行, 经历肝炎、肝硬化阶段而形成肝癌, 实验至16 wk 后, 模型组大鼠肝脏表面粗糙, 可见多个大小不一的灰白色癌结节, 最大者1 cm ×1.5 cm ×0.5 cm, 切面呈结节状, 可见出血和坏死, 癌周肝脏常伴结节或肝硬化
■相关报道
J i a n g 等对肝硬化患者的肝组织miRNA 情况开展了研究, 发现肝硬化发病与miRNA 的表达异常有关, 而且是发生肝癌的重要参考指标, 他们还对人肝癌标本进行了研究, 发现miR-199a 、miR-21和miR-301在肝癌中表达明显, 与预后有关
.
图 1 各组16 wk时超声检查. A: 正常组; B: 模型组; C: 预防组.
128 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2010年1月18日 第18卷 第2期
改变; 预防组的肝脏表面癌结节较模型组有显著改善(图2B, C).
2.2.2 病理组织学: 图3显示各组在16 wk 时肝组织HE 染色情况, 其中正常组: 肝小叶结构正常, 无界面性炎症及纤维化; 肝条索排列规整, 以中央静脉为中心呈放射状排列, 肝细胞无变性、坏死. 模型组: 肝细胞异型性增生明显, 大部分增生肝细胞出现核异质变, 细胞核仁普遍增大, 细胞成倍增大, 染色质粗糙, 出现癌变细胞, 同时呈典型的柱状及腺管样癌巢结构, 且周围组织肝细胞异型性明显, 伴癌细胞浸润, 并可见不同程度的脂肪变性, 部分区域有出血、坏死及静脉癌栓, 周围的肝组织内尚可见微小癌卫星灶. 癌周组织细胞水肿、嗜酸性变、脂肪变性, 并有肝细胞增生灶、增生结节及非典型增生结节, 呈典型的肝硬化表现. 预防组: 虽然大
鼠肝脏可见癌结节, 但与模型组比较, 肝细胞变性坏死减轻. 肿瘤分级结果研究表明, 16 wk 时模型组Ⅲ级发生率为100%(5/5), 而预防组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级发生率分别为40%(2/5)、40%(2/5)及20%(1/5), 两组比较有显著差异(P <0.05).2.3 肝脾指数 与模型组比较, 中药预防组4-20 wk 的肝脾指数均显著下降(表1, 2, 图4, 5).2.4 肝组织miR-199a 的表达 与正常组比较, 模型组和预防组的miR-199a 均有显著上调. 同时, 与模型组比较, 预防组除16 wk 外均出现miR-199a 的表达下调, 两组之间差异显著(P <0.01, 图6, 7, 表3).3 讨论
DEN 是具有中毒性和致癌性双重效应的化学毒剂, 可通过产生亲电子产物脱嘌呤作用连接到
A B C
图 2 各组16 wk时肝脏肉眼观察. A: 正常组; B: 模型组; C: 预防组.
A B C
图 3 各组大鼠16 wk时肝组织病理改变(HE×100). A: 正常组; B: 模型组; C: 预防组.
表 1 各组大鼠肝指数比较 (g/kg, mean±SD)
b
P <0.01 vs 模型组; 4-16 wk每组5只; 20 wk的正常组、模型组、预防组分别为5、3、13只.
■创新盘点
本实验采用DEN 诱导大鼠肝癌模型, 对造模过程中肝组织miR-199a 的表达情况进行动态研究, 有助于阐明肝癌的发病机制及中药预防肝癌的效果.
张斌, 等. DEN诱导大鼠肝癌形成中miR-199a的表达机制及健脾解毒法的干预作用
129
DNA 双链上, 使DNA 双链随机内收而导致DNA 编码错误引发机体损伤, 已经广泛用于原发性肝癌的诱癌模型, 该模型经过中毒损伤-增生硬
化-癌变3个阶段, 病理类型和人类肝癌发生过程相似[12,13]. 本研究发现, 正常组没有发现肿瘤形成, 模型组和预防组大鼠早期肝脏表面变粗糙, 质地较柔软, 边缘锐薄, 切面呈斑剥状, 诱癌至12 wk 肝脏表面和实质内出现大小不等的结节, 质地变硬, 16 wk 后结节变硬, 个别直径>2.5 cm, 有结节型、巨块型和弥漫型, 模型组和预防组在16 wk 后成瘤率为100%, 是比较理想的肝癌动物研究模型.
中医中药防治肿瘤在我国有悠久的历史, 具有独特的机制与效应, 在肝癌的预防中同样具有重要的地位, 其中中药复方是根据中医理、法、方、药的理论组方并经过实践确定下来的
2
a
P <0.05, b P <0.01 vs 模型组; 4-16 wk每组5只; 20 wk的正常组、模型组、预防组分别为5、3、13只.aggressive翻译
表
3 各组大鼠肝组织miR-199a的表达 (mean±SD)b
P <0.01 vs
naked
模型组; 4-16 wk每组5只; 20 wk的正常组、模型组、预防组分别为5、3、5只.
140120
100806040200
t /wk
肝指数(g /k g )
图 4
各组肝指数动态比较.
654321
t /wk
脾指数(g /k g )
图 5 各组脾指数动态比较.karl lagerfeld
6543210
t /wk
实战经验m i R -19
9a 的P C R 检测
正常组模型组中药组
图 7 各组肝组织miR-199a的表达. b P <0.01
vs 模型组.
图 6 miR-199a扩增和熔解曲线. A: 扩增曲线; B: 熔解曲线.
1.0e+0001.0e+001indigo
1.0e+0021.0e+0031.0e+0041.0e+0051.0e+006
1 4 8 1
2 16 20 24 28 32 36 40
Cycle Number
D e l t a R n
Delta Rn vs Cycle
A
0.100.080.060.040.020.00-0.02
60 65 70 75 80 85 90 95
Temperature (℃)
D e r i v a t i v e
Dissociation Curve
B
■应用要点
本研究证实健脾解毒方有预防DEN 诱导大鼠肝癌发生的作用, 其机制可能部分与下调miR-199a 的表达有关, 为中药预防肿瘤的作用提供理论依据.
