诱饵蛋白的自激活检测
1、材料
● 克隆好的pGBKT7-bait
● 足够的Y2HGold细胞
● SD/-Trp/X-a-Gal 平板
● SD/-Trp/X-a-Gal/AbA 平板
2、转化100ng pGBKT7-bait 至Y2HGold细胞。
3、涂板，100ul （稀释10倍和100倍）
SD/-Trp = SDO
SD/-Trp/X-a-Gal = SDO/X
SD/-Trp/X-a-Gal/AbA = SDO/X/A
4、培养3-5天后预期的结果：
样品 | 选择性平板 | 明显的2mm菌落 | 颜色 |
诱饵蛋白自激活检测 | SDO | Yes | 白 初中英语单词 |
诱饵蛋白自激活检测 | SDO/X | Yes | 白或者很浅淡的蓝 |
诱饵蛋白自激活检测 | SDO/X/A | No | N/A |
阳性对照（之前） | DDO/X/A | customsYes | 蓝 |
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诱饵蛋白毒性的检测
1、材料
● 足够的Y2HGold 细胞
● SD/-Trp 平板
● SD/-Trp 液体培养基
2、转化下面两种质粒（100ng）：
pGBKT7（空载）、pGBKT7+bait
3、涂板（稀释10倍和100倍）至SD/-Trp 平板。
4、培养3-5天：如果诱饵蛋白有毒性，转化后的菌落明显小于空载的菌落。
酵母双杂交筛库
1、材料
● 构建好的文库（买的还是我们自己构建的？）
● 已经转化诱饵蛋白的长在SD/-Trp 上的Y2HGold
● SD/-Trp 液体培养基
● 2*YPDA 液体培养基
● 0.5*YPDA 液体培养基
● 卡纳抗生素（50mg/ml）
frontier business company● YPDA+25%甘油
● 以下选择性SD平板：
平板 | 缩写 | 平板数 |
| tyra banks SD/-Trp | —— | 5-10 (100mm 平板) |
SD/-Leu | —— | 5-10 (100mm 平板) |
SD/-Leu/-Trp | DDO | 5-10 (100mm 平板) |
SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA | DOO/X/A | 50-55 (150mm 平板) |
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA | QDO/X/A | 5-10 (100mm 平板) |
| | |
2、构建诱饵载体，检测其自激活和毒性。
3、对照实验。
4、诱饵菌株（Y2HGold [pGBKT7+bait]）的过夜浓缩培养：
a．挑一新鲜、大的（2-3mm）菌落至50ml的SD/-Trp 液体培养基；
b．30℃，250-270 rpm培养至OD600为0.8（16-20h）；
c．1000g，离心5min，弃上清；
d．用SD/-Trp液体培养基（4-5ml）重悬，使得细胞浓度大于1*10^8每ml。
【细胞可用血细胞计数器计数】
5、混合文库菌株和诱饵菌株：
a．室温水浴解冻1ml分装的文库菌株，取10ul涂布至100mm的SD/-Leu 平板，用于滴度测定；
apl b．将1ml的文库菌株混合4-5ml的诱饵菌株于灭菌的2L锥形瓶中；
c．加45ml的2*YPDA 液体培养基（加有50ug/ml卡纳）；
d．用1ml的2*YPDA 液体培养基冲洗装有文库菌株的管子两次，并加到2L锥形瓶中。
6、30℃培养20-24h，慢摇（30-50 rpm）。
7、20h后取一滴菌液在相差显微镜下观察（40*），如果合子存在，进行step 8，否则让其再孵育杂交4h。
8、1000g离心10min。
9、同时用50ml 的0.5*YPDA（加50ug/ml卡纳）冲洗锥形瓶，再用其重悬细胞。
10、1000g再离心10min，弃上清。
11、用10ml的0.5*YPDA/Kan重悬，计算细胞和培养基的总体积。
【例：10ml培养基+1.5ml细胞=11.5ml】
12、取稀释10倍，100倍，1000倍和10000倍的培养液涂布至以下100mm平板，30℃培养3-5天。【计算克隆数】
● SD/-Trp
● SD/-Leu
sca● SD/-Leu/-Trp(DDO)
13、剩余的培养液每个150mm的DDO/X/A（50-55个）平板涂布200ul。30℃培养3-5天。
14、从培养了3-5天的DDO平板上计数筛选的克隆数（二倍体）。【至少要1*10^6个】
筛选的克隆数=二倍体cfu/ml *重悬液的体积（ml）
15、检测杂交效率。
a．测算生活力实习医生格蕾剧情介绍
buzzerbeatSD/-Leu上的cfu/ml数=文库的生活力
SD/-Trp上的cfu/ml数=诱饵的生活力
SD/-Leu/-Trp上的cfu/ml数=二倍体的生活力
【其中诱饵和文库生活力较低的为“limiting partner”】
dhpb．
16、 用灭菌的牙签或者黄枪头将长在DDO/X/A的蓝色菌落挑至更加严格的QDO/X/A平板上。
17、所有的QDO/X/A阳性相互作用必须做进一步的分析，以确定重复数并验证真正的相互作用。
阳性相互作用的验证和文库质粒的拯救？
A：酵母菌落PCR分析以消除重复克隆
1、 用Matchmaker Inrt Check PCR Mix2 扩增文库插入片段；
2、 电泳分析PCR产物；
3、 如果有很多的菌落具有相同的AD/文库片段，进行另一批50个克隆的PCR分析；
4、 为了尽快验证克隆，回收纯化PCR产物并用T7引物进行测序。
B：拯救并分离能激活报告基因的文库质粒
1、分离酵母中的文库质粒
酵母细胞的转化可以包含一种以上的相关质粒，即有可能包含了能激活报告基因的文库质粒，也有可能包含了一种甚至几种不能表达相互作用蛋白的文库质粒。
所以如果在拯救文库质粒之前没有先分离酵母中没有相互作用的文库质粒，之后的拯救中有可能得到没有相互作用的文库质粒。
因此，应该每次挑一个蓝色菌落，在DDO/X平板上多划板2-3次。
2、拯救酵母中的文库质粒
fis
用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit 提取长于QDO/X上的酵母质粒。
如果诱饵质粒是用pGBKT7（带卡纳抗性基因）克隆的，可以用带有100ug/ml氨苄的LB培养基来筛选文库质粒，可用普通的DH5a进行转化。
C．除去假阳性，识别真阳性
1、材料
● 足够的Y2HGold 细胞
● SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal平板=DDO/X
● SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA=QDO/X/A
