实验步骤说明**：
1. 诱饵质粒pGBKT7-bait的构建
2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测【重要的前期准备】
3. 人胰腺cDNA文库的滴定和扩增【不用做了，直接用质粒】
4. 转化AH109酵母后转化子（阳性克隆）的筛选【顺序转化或共转化】
5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】
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2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测
2.1 LacZ自激活的检测.
2.2 HIS3自激活的检测
2.3 融合蛋白对酵母菌的毒性检测
4. 文库转化AH109酵母后转化子的筛选
4.1 文库质粒转化pGBKT7-bait/AH109酵母
使用标准的PEG/LiAc转化法将文库质粒转化入已含有pGBKT7-bait质粒的AH109酵母，涂布在SD-Ade-His-Leu-Trp平板上进行重组子筛选
4.2 报告基因ADE2、HIS3和lacZ激活的验证
ADE2、HIS3的激活：酵母能够在SD-Ade-His-Leu-Trp平板生长
LacZ的激活：β-半乳糖苷酶显色反应呈蓝色
4.3 pACT2-cDNA质粒的获取：
①从酵母中抽提质粒，得到pGBKT7-bait和pACT2-cDNA的混合物
②转化E. coli，涂布在含Amp的LB平板上，由于质粒不相容性，转化子中便只含有pACT2-cDNA质粒
③从转化成功的E. coli中抽提出pACT2-cDNA质粒
5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】
5.1 由于酵母双杂交的假阳性很普遍，所以筛选得到相互作用蛋白的cDNA序列之后，还应将分离出的各种pACT2-cDNA再次单独转化pGBKT7-bait/AH109酵母，即一对一验证，再次检测它们对报告基因的激活情况，排除假阳性
5.2 将pACT2-cDNA质粒送测序，得到cDNA片段的序列，在NCBI数据库Blast查出其对应的蛋白质
5.3 另外，还必须分析这些pACT2-cDNA质粒的构建情况。由于商品文库构建的特殊性，要特别关注这些插入的cDNA片段是否发生了frameshift
5.4 在上述验证都通过的情况下，仍然需要用诸如免疫共沉淀、GST-pull down、细胞共定位等实验来对这些相互作用来进行验证
具体的操作步骤请仔细参看clontech公司的这三个操作手册：
相关质粒载体【更多详细信息见质粒图谱】
酵母双杂交系统3的质粒信息
| Fusion | 表位 | 酵母筛选标记 | 细菌筛选标记 |
Cloning vectors pGBKT7 | DNA/bait | c-Myc | TRP1 | kanamycin |
Control vectors pCL1 | GAL4 | | LEU2 | ampicillin |
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图2.3 pGBKT7的限制性酶切图谱
pGBKT7的多克隆位点图谱
pCL1质粒图谱
另外附上：文库质粒的载体pACT2 和 AD-prey构建的载体pGADT7的信息：
sometimes when we touch实验所用菌株基因型及其用途
菌株 | 基因型 | 用途 |
E coli DH5α | F-ф80dlacZ△M15 recAl endAl gurA96 thi-1 hsdR17(rk-mk+) supE44 relA1 deoR △（lacZYA-argF）U169 | 用于质粒的扩增与转化 |
AH109 | MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4, gal80 LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 : : MEL1UAS-MEL1 TATA-lacZ | 用于酵母双杂交中的诱饵融合蛋白的宿主菌及酵母双杂交筛选 |
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AH109酵母菌的报告基因：
AH109酵母菌的表型：
培养液和固体培养基
● 大肠杆菌培养基及相关试剂
LB培养基：
加蒸馏水至1000mL，调整pH到7.0，高温高压灭菌。
固体LB培养基：在液体LB培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5-2.0％。
配制抗生素培养基时，氨苄青霉素的最终浓度为60μg/mL，卡那霉素的最终浓度为50μg/mL。
● 酵母培养基及相关试剂【注意：含有葡萄糖，灭菌时间不要超过20min，一般15min，过长时间导致碳化变黑】
无氨基酸酵母氮源（YNB）为Difco产品；L-Arginine HCl、L-Histidine HCl monohydrate、L-Lysine HCl、L-Uracill购自Sigma；腺嘌呤半硫酸盐（Adenine hemisulfate salt）购自Amresco；其它各种氨基酸均为国产分析纯。
YPD培养液：
蛋白胨 20g
如何缓解工作压力酵母提取物 10g
葡萄糖 20g
加水至1000mL，调pH5.8，高温高压灭菌。
YPDA培养液：在放弃的英文1L YPD培养基中加入15ml 0.2％腺嘌呤半硫酸盐至终浓度为0.003％，调pH5.8，灭菌
0.2%腺嘌呤半硫酸盐配方：0.4387g Ademin Sulfate 溶于200ml ddH2O formation过滤灭菌，4℃保存
固体YPDA培养基：YPDA培养液中加入琼脂粉至浓度为2.0％。
10×省却成分培养基（简称10×DO培养基）：
按照下表的配方分别配制：
一缺婴儿英语10×DO：10×DO/-Trp，10×DO/-Leu
二缺10×DO：10×DO/-Trp/-His，10×DO/-Leu/-Trp
英语音标mp3下载
高考英语改革三缺10×DO：10×DO/-Trp/-Leu/-His
四缺10×DOswep：10×DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade
各种氨基酸在10×DO溶液中的浓度（按需要省去部分氨基酸）
氨基酸 | 10×浓度 |
L-Adenine hemisulfate salt | 200 mg/L |
L-Arginine HCl | 200 mg/L |
L-Histidine HCl monohydrate | 200 mg/L |
L-Isoleucine | 300 mg/L |
L-Leucine | 1000 mg/L |
L-Lysine HCl | 300 mg/L |
L-Methionine | 200 mg/L |
L-Phenylalanine | 500 mg/L |
L-Threonine | 2000 mg/L |
L-Tryptophan | 200 mg/L |
L-Tyrosine | 300 mg/L |
L-Uracil | 200 mg/L |
L-Valine | 1500 mg/L |
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完全极限培养基(亦称缺陷型培养基、选择性压力培养基)：
YNB 6.7g
10×DO 100ML
Gluco 20g
加水至1000mL，
调pH5.8，灭菌。
固体培养基：上述液体培养基加入琼脂粉至浓度2%。
酵母转化试剂【化学法转化】
10×TE缓冲液： 0.1M Tris-HCl，10mM EDTA (pH 7.5)，高压灭菌。
50%(w/v)PEG3350：PEG3350 50g,用灭菌的去离子水溶解，至体积达100mL。
10×LiAc ：1.0M LiAc，用稀释的醋酸调至pH7.5，高压灭菌。
PEG/LiAc溶液（现用现配）：4/5体积的50%PEG3350, 1/10体积的10×TE缓冲液和1/10体积的10×LiAc混匀，备用。
1×TE/1×LiAc溶液（现用现配）：1/10体积的10×TE缓冲液，1/10体积的10×LiAc，4/5体积的灭菌的去离子水，混匀，备用。
担体DNA 10mg/ml：0.5g 鲱鱼精DNA溶于50ml TE中，磁力搅拌3h，分装于1.5mlEP管，-20℃保存。用时超声或沸水浴10min
β-半乳糖苷酶滤纸显色分析试剂
X-gal储备液：X-gal溶于二甲基甲酰胺中，浓度20mg/mL，-20℃避光保存。
Z Buffer：
Na2HPO4·7H2O | 16.1g/L |
NaH2PO4·H2O | 5.50g/L |
KCl | 0.75g/L |
MgSO4·7H2O | 0.246g/L |
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调pH值至7.0，高压灭菌。
Z Buffer/X-β-gal混合液(现用现配)：
Z缓冲液 | 100mL |
β-巯基乙醇 | 0.27mL |
X-gal储备液 | 1.67mL |
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感受态酵母菌的制备
①将酵母菌AH109菌株划线接种于YPDA平板上，30℃培养3-5d后，平板上长出白色或粉红色克隆；
②以灭菌的牙签挑取1个直径在2-3mm的克隆接种于装有1mL YPDA液体培养基的Eppendorf管中(若克隆直径小于2mm，应挑取数个克隆)，剧烈震荡5min以打散菌团；
③将之转入含50mL YPDA培养基的三角瓶中，于30℃ 250rpm摇动培养16-18h，至酵母菌
繁殖的稳定期(OD600>1.5)；
④取30mL上述过夜培养物转入含300mL YPDA的三角瓶中，检查稀释培养物的OD600值，若必要，加入更多的过夜培养物直至OD600=0.2-0.3；
⑤于30℃ 230rpm继续摇培养3h，此时OD600应为0.4-0.6；
⑥收集培养菌液于50mL离心管中，1000×g，室温离心5min，弃上清；
⑦以25-50mL灭菌TE或蒸馏水重悬细菌沉淀，1000×g，室温离心5min，弃上清；
⑧用1.5mL新鲜制备的、灭菌的1×TE/1×LiAc重悬沉淀，即为感受态酵母菌。
质粒转化酵母
转化实验分组
组别质粒 | 培养基 | 预期LacZ表型 |
阳性对照pCLl | SD/-Leu | 蓝色 |
阴性对照pGBKT7 | SD/-Trp | 白色 |
实验组pGBKT7-bait | SD/-Trp | 白色 |
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1 clo to you 原唱0.1μg诱饵质粒pGBKT7-bait、阴性对照质粒pGBKT7和阳性对照质粒pCLl分别与0.1mg鲱鱼精DNA于一新的1.5mL离心管中，混匀；
②加入100μL酵母感受态细胞，震摇充分混匀；
③加入600μL无菌的PEG/LiAc溶液，高速震摇以混匀；
④30℃ 200rpm摇动30min；
⑤加入70μL DMSO，轻轻颠倒混匀，切勿震摇；
⑥42℃水浴中热激(热休克)15min，冰浴1-2min；
⑦室温14000rpm离心5c，移去上清，以500μL无菌的1×TE缓冲液重悬细胞；
⑧取100μL涂布于相应的营养缺陷平板上，平放几分钟，至液体渗入琼脂中为止；
⑨于30℃倒置培养，进行营养缺陷型筛选，直至克隆出现，一般需要2-4天。
β-半乳糖苷酶滤膜分析
①用新鲜(如30℃生长2-4d)的，直径在1-3mm的酵母克隆进行β-swoosh半乳糖苷酶分析；
②加入2-2.5mL新鲜配制的Z Buffer/X-gal溶液到干净的100mm的培养皿中；
