中国医药工业杂志 Chine Journal of Pharmaceuticals 2010, 41(9) · ·
683氟康唑(fluconazol ，1)属三唑类广谱抗真菌药，通过高度选择性地抑制真菌细胞色素P-450甾醇C-14-α-脱甲基作用，使真菌内的14-α-甲基甾醇堆积，从而抑制真菌的繁殖。文献[1-3]报道了HPLC 法测定血浆中的1，但实际操作中发现内源性成分干扰1的测定。本研究建立了LC-MS/MS 法测定人血浆中的1，灵敏度高、专属性强、重现性好，适用于1的药动学研究。1 仪器与试药
人血浆中氟康唑的LC-MS/MS 法测定
杜旭召1，赵 曦1*，张彦玲1，杨汉煜1，任进民2
(1. 石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司，河北石家庄 050051；2. 河北医科大学第二医院，河北石家庄 050000)摘要：建立了LC-MS/MS 法测定人血浆中氟康唑的浓度。采用C 18色谱柱，以甲磺酸酚妥拉明为内标，流动相为甲醇-2 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.05％甲酸)(60︰40)，电喷雾离子化源，正离子多离子反应监测，监测离子为m /z 307.2→238.2(氟康唑)和m /z 282.2→212.2(甲磺酸酚妥拉明)。氟康唑在0.03～10 µg/ml 浓度范围内线性关系良好。提取回收率大于90.9％，日内和日间RSD 均小于7％。
关键词：氟康唑；液相色谱-串联质谱；血药浓度；测定
中图分类号：R917；TQ460.7+2 文献标志码：A 文章编号：1001-8255(2010)09-0683-03
收稿日期：2010-03-02；修回日期：2010-06-09
作者简介：杜旭召(1978-)，男，工程师，从事药物制剂及分析研究。
通信联系人：赵 曦(1979-)，男，工程师，从事药物分析及药物动力学研究。
Tel ：*************,87896860E-mail ：*****************
Determination of Fluconazol in Human Plasma by LC-MS/MS
DU Xuzhao 1, ZHAO Xi 1*, ZHANG Yanling 1, YANG Hanyu 1, REN Jinmin 2
(1.Pharmaceutical Rearch Institute of Shijiazhuang Pharmaceutical Group Co.,Ltd., Shijiazhuang 050051;
2. The Second Hospital of Hebei Medical Uniersity, Shijiazhuang 050000)
ABSTRACT : A LC-MS/MS method was established for the determination of fluconazol in human plasma. A C 18 column was ud with phentolamine mesylate as the internal standard, with methanol-2 mmol/L ammonium acetate solution (containing 0.5％ formic acid )(60︰40) as the mobil
e pha. ESI was applied and operated in positive ion multiple-reaction monitoring mode. The detected ions were m /z 307.2→238.2 (fluconazol ) and m /z 282.2→212.2 (phentolamine mesylate ). The calibration curve of fluconazdol was linear in the concentration range of 0.03-10 µg/ml. The average extraction recovery was over 90.9％. The intra- and inter-day RSD s were less than 7％.
Key Words : fluconazol; plasma concentration; LC-MS/MS; determination
API 4000型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子化源(ESI 源)，Analyst1.4.1软件(美国AB 公司)。20A 型液相色谱系统，包含LC-20AB 型二元梯度泵、LC-20AB 型在线脱气机、SIL-20A 型自动进样器、CTO-20A 型柱温箱(日本岛津)。
1对照品(批号100314-200402，纯度100％)和甲磺酸酚妥拉明(2，内标)对照品(批号100110-200602，纯度100％)均购自中国药品生物制品检定所。1片(受试制剂，石家庄欧意药业有限公司，规格150 mg ，批号090601)，1胶囊(参比制剂，辉瑞制药有限公司，规格150 mg ，批号85892013)。甲醇为色谱纯，甲酸、乙酸铵为分析纯，水为纯净水(电导率1.4 µs/cm )。
2 方法与结果2.1 检测条件2.1.1 色谱条件
药品分析与质控
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684色谱柱Venusil ASB C 18柱(2.1 mm×50 mm ，5 µm )；流动相甲醇-2 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.05％甲酸)(60︰40)；流速0.3 ml/min ；进样量5 µl ；柱温20 ℃。2.1.2 质谱条件
离子源电喷雾离子化(ESI )源；喷雾电压4 500 V ；雾化温度450 ℃；雾化气NEB (GAS 1) 30 L/min ；帘气(CUR )30 L/min ；碰撞气(CAD )8 L/min ；辅助气AUX (GAS 2)45 L/min ；检测方式 正离子多离子反应监测(MRM )；监测离子m /z 307.2→238.2(1)，m /z 282.2→212.2(2，内标)；驻留时间(dwell time )100 ms 。2.2 溶液配制
1对照品溶液：精密称取1对照品25 mg ，置25 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1 mg/ml 的1对照品贮备液。精密量取1 ml ，置10 ml 量瓶中，用空白血浆定容，并分别用空白血浆稀释制得相应
浓度为10、3、1、0.3、0.1和0.03 µg/ml 的系列浓度1对照品溶液。
内标溶液：精密称取2对照品25 mg ，置25 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1 mg/ml 的内标贮备液。精密量取50 µl ，置250 ml 量瓶中，用甲醇定容，得浓度为200 ng/ml 的内标工作液。2.3 血浆样品处理
取血浆100 µl ，依次加入甲醇和内标工作液各200 µl ，涡旋30 s 混匀，离心(12 000×g )5 min ，取上
清液100 µl 置2 ml 离心管中，加水500 µl ，涡旋30 s 混匀后进样，记录主峰和内标峰面积，用标准曲线法计算血浆样品的1浓度。2.4 专属性试验
取空白血浆、空白血浆加1(0.03 µg/ml )和2(200 ng/ml )、志愿者服药后24 h 的血浆样品，照“2.3”项下方法操作，色谱图见图1。1和2的保留时间约1.7和1.4 min ，内源性物质不干扰测定。
2.0
3.04.05.0/u g .m l -
1
t /min (m /z 307.2 238.2)
4008001 2001 6002 0002 4000.20.6
1.00.0
4.0×10-4
8.0×10-41.2×10-51.6×10-52.0×10-52.4×10-52.8×10-53.2×10-53.5×10-5
0.2
0.6
1.0 1.4 1.8
43662.2 2.6
0.0
2.0×10-4
4.0×10-46.0×10-48.0×10-41.0×10-51.2×10-51.4×10-5
0.20.6
1.0 1.4 1.8
2.2 2.60.04.0×10-4
firewire8.0×10-41.2×10-51.6×10-52.0×10-52.4×10-52.8×10-53.2×10-5
A
B
A ：空白血浆+1(0.03µg/ml )+2(200ng/ml )；
B ：受试者服药24h 后血样1-1；2-21
条件状语从句1
2
2
3.0
cps cps 3.0
3.0
cps cps t /min (m /z 282.2 212.2)
t /min (m /z 307.2 238.2)
t /min (m /z 282.2 212.2)
2.5 线性试验
取“2.2”
A ：空白血浆+1(0.03 µg/ml )+2(200 ng/ml )，
B ：受试者服药24 h 后血样
1-1；2-2
图1 血浆中1、2的LC-MS/MS 色谱图
项下方法操作，以1的浓度c 为横坐标，1、2峰面积之比R 为纵坐标，用加权最小二乘法(1/c 2)进
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行线性回归，得1的回归方程为R＝0.258c-8.24×10-5，r＝0.997 8。结果表明，1在0.03～10 µg/ml浓度范围内线性关系良好。定量限为0.03 µg/ml。
2.6精密度与回收率试验
照“2.3”项下方法制备低、中、高3个浓度(0.06、1和8 µg/ml)的血浆样品，各6份，分别进样测定，日内、日间RSD(％，n=6)分别为3.3、1.4、2.5和6.7、3.3、2.6；1的回收率为90.9％、92.2％和96.3％。内标溶液同法处理，回收率为89.3％。
2.7稳定性试验
将1(0.06和8.0 µg/ml)血浆样品分别于室温放置4 h、处理后放置24 h、经3次冻融循环及-70 ℃冻存40 d，考察其稳定性。1峰面积的RSD(％，n=3)分别为1.8、2.6，2.1、2.7，2.4、3.6以及2.6、
1.3。结果表明1血样在上述条件下均稳定。
2.8血药浓度测定
20名男性健康志愿者，年龄(20.4±1.0)岁，体重(63.6±6.7)kg，试验前经体检证实心、肝、肾功能和血糖等均正常，受试前两周及试验期间未服用任何药物，本试验方案经河北医科大学第二医院伦理委员会批准。20名男性健康志愿者单剂量口服1片(1胶囊)150 mg，分别于服药前及服药后0.33、0.67、1、1.5、2、3、5、8、12、24、48、84和120 h上肢静脉取血3 ml，置肝素离心管中，混合后离心10 min，血浆样品于-70 ℃保存，依法测定，平均药-时曲线见图2
。
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
c
观众英语/
密苏里科技大学u
g
.
m
l
-
1
icti
-受试制剂；-参比制剂
A：空白血浆+1(0.03µg/ml)+2(200ng/ml)；
优美英语文章
1-1；2-
2
t/h
图2健康受试者口服1(150 mg)后的平均药-时曲线
3讨论
outstaff
本研究参考文献[1-3]摸索HPLC法测定血样中
1的条件，经调整流动相比例、更换多个厂家的色
谱柱，结果显示内源性成分干扰测定，方法专属性
无法满足生物样品测定要求。因此采用专属性更高
的LC-MS/MS法，本法不存在基质效应，回收率
接近100％，且血浆中的内源性成分不干扰测定，
适用于1的人体药物动力学和生物等效性研究。
参考文献：
[1]胡霞敏, 杨晓燕, 胡先敏, 等. 氟康唑胶囊在健康人体
的药代动力学和生物等效性[J]. 中国临床药理学杂志,
2006, 22(6): 429-431.
[2]杨佳丹, 郭瑞臣, 董志. 氟康唑胶囊在健康人体的药代
动力学及生物等效性[J]. 中国临床药理学杂志, 2006,
22(2): 122-125.
[3]张玉, 马力, 王佩佩. 氟康唑口服液人体相对生物利
mobile phone tools用度和生物等效性[J]. 中国医院药学杂志, 2007, 27(4):
470-472.
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B41-10 增加NADH/NAD(+)的比例可提高根癌农杆菌中辅酶Q
10
的产量 Koo BS等[Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74: 895]
本研究对辅酶Q
10
的高产菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A603-35进行了研究，发现当增加产NADH酶的表达水平时，NADH/NAD(+)的比例为1.1，比亲株C58(比例为0.2)高。同时在A603-35菌株中胞内NADH/NAD(+)比
elegant例与辅酶Q
10
的含量呈正相关。在A603-35中表达3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)后，48 h时的NADH/NAD(+)的比例从
0.8提高到1.2，相应摇瓶中辅酶Q
10
的产量从2.16 mg/g增加到3.63 mg/g干菌量。在培养基中添加羟丁酸后，胞内的NADH/
NAD(+)比例进一步从1.2增加到1.4，辅酶Q
10
的产量提高到5.27 mg/g干菌量。
[龚桂花译胡又佳校]B41-11 通过途径调控的遗传操作来提高链霉菌的次级代谢产量 Chen Y 等[Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86(1): 19]随机突变筛选是一个耗费时间和资源但十分有效的传统手段。采用重组DNA技术的代谢工程为提高发酵效价提供了一个新颖的理性化筛选方法，对于工业中传统的经验方法是一个很好的补充。通过对掌控次级代谢产物生产的特异调控系统进行操作是能有效提高发酵水平的一个重要方面。本研究以产生临床用药最多的链霉菌的次级代谢为例，证明对天然调控网络，尤其是途径特异的调节子对发酵水平改良的影响力和实用性。着重强调了本室在提高菲特霉素(fredericamycin)、C-1027、平板霉素(platensimycin)和平板素(platencin)发酵水平上的研究。
[袁天杰译胡又佳校]
