西北植物学报,2010,30(1):0021-0029
Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.
文章编号:1000-4025(2010)01-0021-09
利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的
SKTI抗虫转基因烟草
宋洪元1，任雪松1，司军1，李成琼1，宋明1，雷建军2
(1重庆市蔬菜学重点实验室，西南大学园艺园林学院，重庆400715;2华南农业大学园艺学院，广州5106
42)
摘要：将置于两个同向lox位点之间的Bar基因表达盒与大豆胰蛋白酶抑制剂SK T I基因表达盒融合后获得相应植物表达载体，转化烟草Wisconsin38后获得对棉铃虫具有明显抗性的S K T I转基因植株。S K T I转基因植株通过叶盘二次转化法导入Cr e基因，对再生植株叶盘进行Bast a的抗性检测，检测Bar基因的删除情况。结果表明：绝大多数再生植株对应叶盘在含8mg/L PP T的筛选培养基上无法再生,Bar基因被删除的效率在38%~ 100%之间。对Bar基因删除区域进行PCR及克隆测序后发现Bar基因表达盒被精确删除。对B ar基因删除植株开花自交获得的分离后代进行N PTÒ抗性检测,5株N P TÒ敏感植株分子检测显示均只含有S K T I基因而无Cre基因存在，为无选择标记基因的SK T I转基因植株。
关键词:Cre/lo x重组系统;SK T I基因；无选择标记；抗虫转基因烟草
中图分类号:Q789文献标识码:A
烤鸭英语Construction of Selectable Marker-free SKTI Transgenic Tobacco
Plants Conferring Resistance Against to Inct by Cre/lox System
SONG H ong-yuan1,REN Xue-song1,SI Jun1,LI Cheng-qiong1,SONG M ing1,LEI Jian-jun2 (1Vegetable Science Key Laboratory of Ch on gqin g,H orticulture an d Landscape Ar chitectu re Coll
ege,S outh west University,
C hongqing400715,Ch ina;2H orticulture C ollege,South China Agricultural University,Guan gzhou510642,China)
Abstract:A binary expressio n vector w as constructed containing the incticidal gene,soybean kunitz tryp-sin inhibito r(SK T I),and a lectable Bar marker gene castte,flanked by lox sites.T he expressio n vecto r w as transform ed into Wisconsin38to bacco plants mediated by Ag robacter ium tumef aciens.The transgenic to bacco plants show ed w ell resistance to cotton bollw orm.T he Cr e gene w as subquently introduced into SK TI transgenic tobacco plants by r e-tr ansform ation.T he Bar gene deletion status was detected by test the resistance to Basta of leaf discs fr om regener ation plants on the medium w ith PPT8mg#L-1in it.The results show ed few discs were able to regenerate norm ally on the medium.T he ex cision efficiency of B ar marker gene castte w as38%to100%,depending on individual re-transformation events.Far ther PCR an-aly s and quencing to the recombination region indicated the ex cisio n of the Bar gene in highly precid manner.T he B ar g ene ex cid plants w er e lf-fertilized to make the SK T I gene gr eg ated from Cr e-N PT Òlocus,5Kan nstiv e plants w ere perform ed PCR analysis for both the SK T I gene and Cre gene,the re-sults indicated all the5Kan nstive plants w ere marker fr ee SK T I trans
genic to bacco plants,by reason of SK TI gene prented but Cr e gene abnted in them.
Key words:Cr e/lox site-specific recombination system;SK T I gene;marker fr ee;transgenic to bacco r esist-*收稿日期:2009-09-16；修改稿收到日期:2009-12-17
基金项目：国家自然科学基金(30200185)；重庆市教委应用基础项目(030208)
作者简介：宋洪元(1973-)，男(汉族)，博士，副教授，主要从事植物遗传育种及生物技术。E-mail:yuah
ant to inct
目前在植物遗传转化过程中主要利用除草剂抗性基因、抗生素抗性基因，在绝大多数情况下，这些筛选标记基因在获得目的转基因植株后已无用处，但这些随目的基因整合进去的筛选标记基因可能出现的潜在问题被大家所关注[1]。如抗除草剂基因是否会造成超级杂草的出现而影响生态平衡；抗生素标记基因是否会通过食物转移至人、畜肠道微生物中，影响抗生素治疗的效果。同时为实现植物多基因聚合的工程改良用同样的启动子及其驱动的筛选标记基因可能导致同源沉默的发生[2]。因此，为促进转基因农作物在生产上的推广应用，培育不带选择标记基因的转基因作物是非常必要的[3,4]。
利用转座子系统[5,6]、共转化系统[7,8]、同源重组[9]以及Cre/lox、FLP/FRT、R-RS等位点特异重组
系统均获得了无选择标记的转基因植物[10]。其中转座子系统和同源重组两种途径因技术路线相对复杂，获得无选择标记转基因植物效率低，在构建无选择标记转基因植物中的广泛应用受到限制[11]。而共转化系统则存在效率低、目的基因与抗性选择标记基因趋向整合于基因组的同一个位点而无法自交分离的问题[12,13]。鉴于上述途径在获得无选择标记转基因植物中存在的各种问题，位点特异重组系统逐渐为大家广泛使用[14]。在各种位点特异重组系统中，由于Cre/lo x系统的重组功能在细菌、真菌、动物以及植物等各种生物中表现高效稳定，在获得无选择标记转基因植物中应用更为普遍[15,16]。目前无选择标记抗虫转基因植物的研究主要集中于Bt基因，采取的手段一般为共转化方式[6,17,18]。鉴于植物蛋白酶抑制剂具有对人体无副作用以及害虫不易产生耐受性等优点[19]，因此，从市场化角度来看，获得无选择标记基因残留的转植物源蛋白酶抑制剂基因农作物抗虫新品种可能更容易被消费者接受。来自大豆的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂SKT I 属于植物蛋白酶抑制剂之一，高越峰等[20]将其转入烟草，获得的转基因烟草具有明显的抗棉铃虫能力，且对胰蛋白酶活性的抑制能力明显高于豇豆胰蛋白酶抑制剂CpT I。鉴于上述原因，本研究尝试利用Cre/lox重组系统具有的重组删除功能，将与SK T I 抗虫基因连锁的筛选标记基因B ar删除，实现无选择标记基因的SK TI抗虫转基因烟草的构建，为在其他重要经济植物中获得无选择标记抗虫转基因植物的研究提供一种新的选择途径。
1材料和方法
电脑学习班1.1植物材料、菌种及载体
用于转化的烟草材料为本验室保存的Wiscon-sin38烟草无菌苗。大肠杆菌菌株E.coli DH5A、分别含植物表达载体pCAlo xBar SKT和pBinCre的农杆菌EH A105(图1)为本实验室保存或构建。pTA2T载体购自TOYOBO公司。
1.2酶和主要生化试剂
T4-DNA连接酶购自Prom eg a公司;Taq DNA 聚合酶、p f u DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Om eg a公司。X-g al、IPTG、DNA m ar ker(K DN A Eco RÑ+H in d Ó)购自上海生物工程有限公司;Basta(草丁膦，主要成分PPT)购自日产化学工业株氏会社。氨苄青霉素(Am picilin)、卡那霉素(Kanamycin)、羧苄青霉
女子谋杀俱乐部图1pCA lo xBarSK T和pBinCre表达载体结构示意图
A.pCAloxBarS KT质粒;
B.pBinCre质粒
Fig.1Schematic r eprentation of pCAlox Bar SKT and pBinCre plasmids
A.Plasm id pC AloxBarS KT;
B.Plasmid pBinCre
22西北植物学报30卷
素(Carbenicilin)、链霉素(Streptomy cin)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)以及细菌培养基(印度进口分装)购自北京鼎国生物技术有限公司；植物DNA提取、植物组织培养以及电泳的各种化学药品为国产分析纯。
1.3方法
1.3.1pCAloxBarSKT转基因烟草植株的获得及抗虫初步鉴定利用农杆菌介导的叶盘转化法，用pCAlox BarSKT转化烟草品种Wisconsin38。在MS+BA 3.0mg/L+IAA0.1mg/L+PPT10 mg/L培养基上进行愈伤组织和芽的分化、诱导。再生植株在M S+IAA0.5mg/L+PPT15m g/L 培养基上进行生根。正常生根转基因植株提取基因组DNA进行相应Bar、SK TI基因的PCR检测。所用引物为Bar基因序列特异的pBar1(5c-CCG-CTCGAGTCTACCATGAGCCCAGAAC-3c)和pBar2 (5c-CCGCTCGAGAT CAGA TCT CGGTGACGGG-3c);SK T基因序列特异引物pSKT1(5c-CGG-GAT CCAT GAAGAGCACCA TCT TCTT T GC-3c)和pSKT2(5c-GCGGAT CCT CA CT CACTGCGA-GAAA GG-3c)。PCR扩增的程序为:94e预变性5 min;94e1min,56e1min,72e1m in30s,35个循环；循环结束后72e延伸10m in。获得的转基因阳性植株进行棉铃虫抗性的初步鉴定。抗虫鉴定采用如下所述方法进行：从棉田采回大小基本
一致的棉铃虫幼虫，称重，每个培养皿中放入1~2头棉铃虫，以非转基因植株烟草为对照，取转基因烟草植株叶片进行离体饲喂，重复3次。饲喂5d后，对棉铃虫再次称重，分析虫体重量增加幅度，同时调查转基因烟草植株叶片被摄食的情况。
1.3.2pCAloxBarSKT转基因植株的二次转化及再生植株的PPT敏感性检测利用农杆菌介导的叶盘转化法，取经过棉铃虫抗性鉴定的pCAlox Bar-SKT转基因植株叶盘进行pBinCre质粒的二次转化。叶盘浸泡农杆菌后，置于MS+ 3.0mg/L BA +0.1m g/L IAA+100mg/L Kan的分化培养基上进行Cr e转基因植株的筛选。在MS+ 3.0m g/L BA+0.1mg/L IAA+8.0mg/L PPT的分化培养基上，以未进行二次转化阳性植株叶盘为对照，对获得的二次转化再生植株叶盘进行PPT的抗性检测。凡叶盘在该培养基上无法分化并逐渐黄化死亡的视为Bar基因删除单株，而正常分化者为未删除植株，并在此基础上统计删除效率。1.3.3Bar基因删除植株的分子检测对叶盘黄化死亡对应二次转化植株进行相应的分子检测、分析。利用Cr e基因上下游引物pCr e1(5c-GACC AT-GGCT CCCAAGAAGAAGA GAAAGCTAA TGTC-CAAT TT-3c，下划线为来自SV40的核定位信号序列)和pCre2(5c-GCCGGA GCT CCT AATCGCCA T-CT TCCAG-3c)以及S K T I、B ar基因的上下游引物进行目的基因的PCR检测。同时，对删除区域剩余序列进行克隆测序分析。利用引物pNos(5c-CA A-GACCGGCAA CAGGATT CAATC-3c，互补于载体上的Nos终止子)和S K T I基因下游引物pSKT2对重组删除区域序列进行PCR扩增，符合预期大小的片段回收后连接到pTA2T载体并测序。
1.3.4无选择标记SKTI转基因植株的获得获得的Bar基因删除植株在开花时进行自交，获得的自交后代成苗后取叶片在400mg/L Kan的溶液中进行抗性检测，凡叶片变白变黄的对应单株被认为是不含Cr e及连锁的N P TÒ基因，提取DNA进行Cr e基因及SK TI基因的PCR检测确认。
2结果与分析
2.1SKTI转基因烟草的获得及鉴定
利用含pCAlox BarSKT质粒的农杆菌浸染Wisconsin38烟草叶盘，获得大量转基因植株。随机抽取其中9株pCAlo xBar SKT转基因单株进行Bar基因及S K T I基因的PCR检测。结果均出现预期大小的目的片段(图2)。表明筛选标记基因Bar及与其连锁的S K T I目的基因均整合进烟草基因组。
离体繁殖对应SK TI转基因阳性单株，并将繁殖后的一部分植株移栽室外，取叶片离体饲喂棉铃虫进行抗虫性的初步鉴定。结果(表1)显示，分别用来自5株转基因植株的叶片饲喂棉铃虫5d后，与非转基因叶片饲喂相比，均表现棉铃虫幼虫体重增加速度变慢，虫体明显瘦小，叶片受损程度小。但不同转基因植株对棉铃虫的抗性表现出较为明显的差异，与食喂前的重量相比，用转基因烟草叶片饲喂5d 后的棉铃虫幼虫虫体的重量增加幅度在3.95~ 6.23倍之间，但均明显低于对照植株饲喂后9.23倍的增加幅度。其中虫体重量增加幅度最低的为SKT5转基因植株(3.95倍)，叶片损害程度在10%~20%之间；增加幅度最大的为SKT9转基因植株(6.23倍)，叶片损害程度在40%以上(表1；图版Ñ,1~3)。
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1期宋洪元，等：利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SK T I抗虫转基因烟草
图2pCAlox Bar SKT转基因烟草的Bar基因和SK T I基因P CR检测
A.pCAloxBarSKT转基因烟草的Bar基因PCR检测;
B.pCAloxBarSKT转基因烟草的S K T I基因PCR检测。M.DNA marker
hue(K DNA/H in dÓ+Ec o RÑ);CK+.pCAloxBarSKT;C K-.非转基因植株阴性对照;1~9.转基因单株
Fig.2PCR analysis of the Bar and SK T I g enes in transgenic to bacco w ith pCA lox Bar SK T
A.PCR analysis of th e Bar gene in trans genic tobacco w ith pC AloxBarS KT;
B.PCR analysis of the S K T I gene
in tran sgenic tobacco w ith pCAloxBarS KT;M.DNA m ark er(K DNA/H in dÓ+Eco RÑ);CK+.pC AloxBarS KT;
CK-.U ntrans form ed plan t;1~9.T he transgenic plant
表1SKTI抗虫转基因烟草离体叶片抗棉铃虫检测
T able1T he resistance t esting of S K T I transgenic tobacco to co tton bo llwo rm
转基因植株T ran sgen ic
plant 饲喂前棉铃虫重量
Cotton bollw orm
w eight befor e
feeding/mg
饲喂5d后虫重
Cotton b ollw orm
w eig ht after feed
for5days/mg
重量增加倍数
Incread
m ultiple
叶片损害程度lavina
Dam age
degr ee of leaftrashbin
CK21.3196.79.23++++
SKT119.278.8 4.10++
SKT218.4101.5 5.52+++
SKT522.689.2 3.95++
SKT723.5112.7 4.80++
SKT919.8123.3 6.23++++注：叶片损害程度分级:+.轻度，叶片损害率<10%;++.中度，叶片损害率为10%~20%;+++.重度，叶片损害率为20%~40%; ++++.严重，叶片损害率>40%。
Note:Grade of leaf damage degree:+.Gentle damage,the leaf dam age proportion<10%;++.M oderate damag e,the leaf damage p rop or-tion for10%~20%;+++.Bad dam age,the leaf damage proportion for20%~40%;++++.Alm os t full damage,the leaf damage proportion >40%.
2.2SKTI转基因烟草二次转化导入Cre基因及Bar基因的删除
2.2.1SKTI转基因烟草二次转化及Bar基因的删除效率分析根据棉铃虫抗性鉴定结果，分别取4株对棉铃虫具有一定抗性的pCAlox BarSKT转基因植株叶盘进行Cr e基因的二次转化，在MS+
3.0 mg/L BA+0.1mg/L IAA+100mg/L Kan培养基上筛选Cre转基因植株。获得的转化单株切取叶盘在含除草剂Basta分化培养基M S+ 3.0m g/L BA+0.1mg/L IAA+8.0mg/L PPT上进行PPT 敏感性分析，结果显示未进行Cre基因二次转化所有单株均正常再生，而二次转化导入Cr e基因后所获得的再生单株叶盘在上述含除草剂Basta分化培养基上培养后，绝大多数单株所对应的叶盘无愈伤组织以及芽的分化，并逐渐黄化、变白死亡，显示该叶盘所对应的再生植株已经失去了Bar抗性基因(图版Ñ,4、5)。但不同SK TI转基因烟草单株通过二次转化导入Cr e基因后，再生植株中B ar基因删除效率在不同SK T I转基因烟草单株之间存在较大的差异(表2)，其删除效率最低仅达到38% (SKT2)，最高则可达100%(S
KT1)。
2.2.2Bar基因删除的分子检测分别取SKT1和SKT7部分在PPT8.0mg/L培养基上不能再生、叶盘黄化死亡所对应的二次转化单株进行Cre 基因和B ar基因的PCR检测。结果来自SKT1的4个单株仅扩增出预期1.0kb的Cr e基因片段，而无B ar基因扩增产物的出现；来自SKT7的6个单株中，有5个单株仅扩增出Cr e基因片段而无Bar 基因扩增产物出现，而另一个单株B6则同时扩增出Cr e基因和较为模糊的Bar基因片段，估计该单株有删除不完全的情况存在(图3)。
进一步对部分已成功删除筛选标记基因B ar
24西北植物学报30卷
表2 不同单株二次转化后再生植株的PPT 敏感性检测
T able 2 PPT nsitivity test to to bacco leaf disc o f SK T I transgenic plants retr ansfo rmed w it h Cr e
SKT 转基因单株S KT tran sgenic
plant
检测的二次转化单株数No.of tested plants
再生株数
No.of regeneration plants on m edium w ith PPT
敏感株数
No.of nsitive plants
删除效率(敏感株数/总株数)
Efficien cy of deletion
(nsitive plants/total plants)/%
chunqingintSKT 1909100SKT 2138538SKT 5114764SKT 7
15
2
13
87
图3 SK T 转基因植株Cr e 基因二次转化后的Cr e 基因和Bar 基因的PCR 检测
M.DNA marker (K DNA/H in d Ó+E co R Ñ);Bar +.质粒pC AloxBarS KT;Cre +.质粒pBinCre;CK -.阴性对照;
A.S KT1转基因植株;A1~A4.SKT 1转基因植株Cr e 基因二次转化单株;
B.S KT7转基因植株;
B1~B6.SKT 7转基因植株Cr e 基因二次转化单株
schoolbagFig.3 PCR analysis the Bar and Cr e genes in the pCAlox Bar SKT
transgenic plants retr ansfo rmed w ith Cr e g ene
M.DNA marker (K DNA/H in d Ó+E co R Ñ);Bar +.pCAloxBarSKT control;Cr e +.pBinCre control;CK -.Negative
control;A.SKT 1trans genic plant;A1~A4.SKT 1transgenic plants retransformed w ith Cre gene;
B.SKT 7transg enic plant;B1~B6.SKT7tran sgen ic plan ts r etran sformed w ith Cr e gene据有
的单株进行PCR 扩增及克隆分析。未进行二次转化植株DNA 用引物pBar1和pSKT2扩增出2.1
kb 大小片段；而二次转化引入Cr e 基因删除Bar 筛选标记基因后获得的再生植株用引物pN os 和pSKT2扩增出1.2kb 大小目的片段(图4)。用上述引物分别对未进行Cr e 基因二次转化的SKT 1、SKT 7植株和来自SKT1的两个Bar 基因删除植株(A1、A2)、SKT7的3个Bar 基因删除植株(B1、B2和B3)进行PCR 分析(图5)，结果用pBar1和pSKT2引物从SKT1和SKT 7植株中均扩增出了预期的2.1kb 大小片段，而用引物pNo s 和pSKT 2从SKT 1和SKT 7B ar 基因删除植株中均扩增出了预期的1.2kb 大小片段(图5)。这表明位于3个同向lox 位点之间的B ar 基因表达盒片段确被成功删除。
对Bar 基因删除植株中均扩增出的1.2kb 大小片段进行TA 克隆后进行删除区域的测序分析。测序结果表明，位于2个同向lox 位点中间的Bar 基因表达框失去，原有的两个同向lox 位点变为1
个，而lox 位点旁边的限制性酶切位点保留完整，表明通过二次转化引入Cr e 基因,SK TI 转基因烟草中原有的筛选标记基因Bar 已被精确删除(图4；图版Ñ,6)。
2.3 无选择标记SKTI 转基因烟草的获得
从SKT1二次转化后B ar 基因删除的A1单株自交后代群体中随机取37株幼苗叶盘置于含Kan 400m g/L 浓度的培养盘内培养7d，通过叶盘对卡拉霉素的抗性检测对应单株内是否含有相应的Cr e -N P T Ò位点。检测结果显示共有6株变黄、变白(图版Ñ,7红色圆圈标记的叶盘)，对kan 反应敏感，表明其对应的单株中应不含Cre -N P T Ò位点。分别提取对Kan 敏感的对应5株幼苗(1株死亡)叶片DN A，分别对Cre 基因和SK TI 基因进行PCR 检测，结果5个单株均只有SK T I 扩增产物的出现，而无Cr e 扩增产物出现(图6)。说明重组酶基因Cr e 及与其连锁的N PT Ò筛选标记基因确与目标基因S K T I 分离,5株幼苗为无选择标记的SK-T I 转基因植株。
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1期 宋洪元，等：利用Cre/lox 重组系统获得无选择标记的SK T I 抗虫转基因烟草酒英语
