Nature科学家首次利用CRISPR来加速特定基因在哺乳动物中遗传
撰文丨滕越、关越
责编丨迦溆july的音标
“通常制作同时具有6种遗传修饰的小鼠需要大概5年，而利用基因驱动技术，一年就可以办到。”
在经典遗传学理论中，通过孟德尔定律，亲代等位基因有50%的机会被下一代遗传。2003年，进化生物学家Austin Burt提出了基因驱动（gene drive）理论【1】。一些基因具有自我复制功能，如转座子等，可以利用具有这些功能的元件对目的基因进行改造，这样可以使得后代可以以大于50%的机会偏好性遗传目的基因，随着后代的延续整个群体的基因型都会被改变。即利用超孟德尔遗传（Super-Mendelian inheritance）对生物群体进行遗传学工程改造。这种方法可以改造病原传播群体，比如一些蚊子是疟疾、登革热或寨卡病毒的重要传播源，理论上可以利用这种技术降低疾病的传播率。
近期CRISPR技术的日益成熟加速了基因驱动的发展。CRISPR技术包括gRNA和Cas9两部
分，gRNA引导Cas9对目标DNA进行切割产生双链断裂（double strand break, DSB）。细胞利用自身损伤修复功能对DSB进行修复，通常有两种结果：一种是非同源末端连接修复（non-homologous end joining, NHEJ），NHEJ会在DSB位点引入核苷酸的插入和缺失（inrtions of deletions, indels）发生效率较高，会造成目的基因功能缺失性突变；另一种是同源重组修复（homology directed repair ，HDR），HDR可以以另一条同源染色体或人工外源序列作为模板，实现定向编辑。基因驱动技术利用了CRISPR的HDR，具体过程见下图。2016年6月18日
图片来源: /wiki/Gene_drive
一般情况下，特定突变会以孟德尔方式在群体中遗传。在Cas9和gRNA作用下，通过HDR的机制，杂合型目的基因（在这里标记为Cargo）在个体中趋向于变纯合，从而在遗传中逐步占据优势以至于改变整个群体遗传构成。2014年，来自哈佛大学的科学家们提出了CRISPR应用于基因驱动的想法【2】。2015年，科学家证实了在酵、果蝇和蚊子中， CRISPR可以成功高效地实现基因驱动【3-5】。但是由于遗传机制的差异，这种系统尚未在哺乳动物中成功开发。基因驱动在哺乳动物中可以用来抵抗有害群体的入侵，也可以用于优化实验动物模型。
1月23日，Nature杂志在线发表了来自加州大学圣地亚哥分校（UCSD）Kimberly Cooper实验室的题为Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR–Cas9 in the female mou germline的文章，首次在小鼠中成功开发了基因驱动技术。
在这项研究中，作者进行了精细巧妙的实验设计。用CopyCat这段序列插入到酪氨酸酶基因第四个外显子中，造成酪氨酸酶功能失活（TyrCopyCat）。因为白化病是由酪氨酸酶异常引起，这种方法人为造成了小鼠的白化病，可以根据小鼠的毛发颜色来追踪引入的基因突变（下图）。gRNA附近有mCherry的红色荧光标记，理论上成功实现HDR的小鼠中可以追踪到mCherry的表达。
time for miracle
利用CRISPR-Cas9技术在小鼠中实现基因驱动的策略。图片引自：Nature
soccerfootball不同小鼠中分别带有gRNA的目的基因TyrCopyCat和表达Cas9，这样可以灵活控制CRISPR的反应。将这两种品系的小鼠交配繁殖，基因驱动可能在子代中发生。表达Cas9的小鼠的酪氨酸酶第五个外显子上有chinchilla（南美洲栗鼠）的亚等位基因（ hypomorphic allele），这种小鼠为灰色。Chinchilla与TyrCopyCat的距离有9.1KB，因此在自然条件下，这两个标记间几乎不会发生交换重组。这种实验条件下，理论上交配后会产生三种等位基因（下图），一种是没有发生CRISPR介导的基因表型改变，只有chinchilla，这种基因作为显性存在时小鼠毛发为灰色；一种是发生了CRISPR介导的基因表型改变，但是只有NHEJ过程，因为造成了酪氨酸酶的功能缺失，这种等位基因为显性时，小鼠为白色，但会在酪氨酸酶上检测到indels; 还有一种是发生了HDR的CRISPR改变，这种等位基因为显性时，小鼠为白色，可以检测到chinchilla、Tyr公务员考试技巧CopyCat和mCherry的同时存在，只有这一种才是基因驱动成功的标志。
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作者首先利用Rosa26和H11这两种几乎在所有组织中都能表达的启动子来驱动Cas9，发现
这种条件下得到的主要是NHEJ的基因编辑。控制Cas9的表达对实现基因驱动至关重要。作者随后选择了在生殖系中特异表达的启动子来驱动Cas9，因为生殖系中本身会在减数分裂时发生交换重组，抑制NHEJ可能会促进HDR。实验证实这种策略是有效的，在雌性小鼠中，作者可以观察到72%的HDR发生。基因驱动在雌性小鼠中有效，然而在雄性小鼠中尚不成功。
这项研究证实了CRISPR介导的基因驱动在小鼠中应用成功，虽然在将基因驱动用于控制野生小鼠种群之前，还需要开展进一步的工作，但这一研究结果或有助于开发改良小鼠模型，用于研究复杂的遗传疾病。还需要进一步开展工作以增加雄性和雌性小鼠后代的基因遗传频率，但此次研究所实现的效率足以满足很多实验室的应用要求。同期Nature互文配有相应News & Views文章对此工作进行评论（下图）。
值得一提的是，这项工作在2018年7月被提交到预印本杂志bioRxiv上，当时就引起了主流媒体的强势围观，Nature和Science在都曾讨论过此研究【6, 7】。
rsa北美在线在以制作基因修饰小鼠闻名的Jackson laboratory领导技术研发的Michael Wiles评价此项方法是“非常有用的”。因为很多人类疾病是由多种基因引起的，而制作这种小鼠模型要花费大量时间和人力物力。“通常制作同时具有6种遗传修饰的小鼠需要大概5年，而利用基因驱动技术，一年就可以办到。”
降低英语来自澳大利亚阿莱德莱大学（ the University of Adelaide）的小鼠遗传学家 Paul Thomas称这项研究是“向在哺乳动物中开发基因驱动中迈出的重要的第一步”。Paul Thomas实验室
一直致力于开发小鼠中的基因驱动技术来防治啮齿类生物入侵。
同样来自澳大利亚的小鼠遗传学家Gaétan Burgio评价此工作“是非常好的研究同时具有重要的意义”，“我们之前对啮齿类动物中的基因驱动一无所知，我们曾认为它的效率可能跟在果蝇中同样高，但事实并非这样”。
