血浆Septin9基因甲基化检测质控品制备及其应用
王雪亮;权静;魏萌;徐幸;孔骏;肖艳群;王华梁
【摘 要】目的 制备可模拟临床标本的血浆Septin9基因甲基化(mSEPT9)质控品并用于室间质量评价.方法 选择Septin9区域已发生/未发生甲基化的HeLa/Jurkat细胞进行培养,收集并抽提细胞基因组DNA,经mSEPT9试剂盒检测,依据检测Ct值用阴性血浆稀释分装成含有不同浓度的质控品,对质控品均匀性和稳定性进行评价后,将5个样品随机编号后发送至参评实验室,分析评价回报结果.结果 抽提得到的细胞基因组DNA纯度和浓度均可满足使用需求,且可用作mSEPT9检测的质控品.均匀性和稳定性均符合中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品要求.部分参评实验室出现假阳性和假阴性情况,仅有约55.6％实验室的检测结果(Ct值)呈良好线性相关.9家参评实验室中,7家实验室(77.8％)成绩优秀,1家实验室(11.1％)成绩合格,1家实验室(11.1％)成绩不合格.结论 成功研制血浆mSEPT9检测的质控品并应用于室间质评,有利于评估并提升临床实验室检测能力.钝化
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2019(037)006
【总页数】3页(P445-447)
【关键词】Septin9;Septin9基因甲基化;结直肠癌;质控品;室间质量评价
【作 者】王雪亮;权静;魏萌;徐幸;孔骏;肖艳群;王华梁
【作者单位】上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126;上海市临床检验中心分子生物学室,上海200126
【正文语种】中 文
日耳曼语族
【中图分类】R446
血浆Septin9基因甲基化(mSEPT9)是诊断结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的特异性生物标志物[1-4]。目前，国家食品药品监督管理总局已先后批准了2种结直肠癌血浆mSEPT9检测的试剂盒，临床实验室也逐步开展相关项目的检测。但血浆mSEPT9检测较为繁琐，涉
及血浆制备、循环肿瘤DNA提取、DNA亚硫酸盐转化、荧光PCR及结果分析等环节，任一环节均影响检测结果的准确可靠。为合理评估实验室检测血浆mSEPT9的能力，本研究利用Septin9区域已发生/未发生甲基化的HeLa/Jurkat细胞制备可模拟临床标本的质控品，评价其均匀性和稳定性，并用于室间质量评价中以期提升其检测质量。
1 材料与方法
1.1 样品来源 人宫颈癌细胞HeLa(Septin9区域已发生甲基化)[5]和急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat(Septin9基因未甲基化)购自中国科学院细胞库，分别用于制备阳性和阴性质控品。阴性血浆为上海市血液中心提供，经mSEPT9试剂盒检测确认，用于稀释质控品。
1.2 主要仪器与试剂 NanoDrop One超微量紫外分光光度计、ABI 7500荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Centrifuge 5424R高速离心机(德国Eppendorf公司)。mSEPT9检测试剂盒(PCR荧光探针法)购自北京博尔诚公司;DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清(fetal bovine rum，FBS)均购自美国Gibco公司，QIAamp DNA Mini Kit购自德国Qiagen公司。
1.3 质控品制备 HeLa和Jurkat细胞分别培养在含有10% FBS的DMEM和RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱内培养，每周传代3～4次，传至第10代时2 000 r/min收集细胞。用QIAamp DNA Mini Kit抽提收集细胞基因组DNA，分光光度法测定其吸光度值，纯度和浓度符合要求后，用阴性血浆稀释基因组DNA，作为阳性和阴性质控品原液。
affect用法>理会的意思
1.4 质控品定值与分装 用mSEPT9试剂盒检测阳性和阴性质控品原液。提取质控品游离DNA，依次进行裂解、DNA结合和洗涤、洗脱、亚硫酸盐转化与结合、洗涤、干燥、洗脱等步骤，得到亚硫酸盐转化的DNA。用ABI 7500荧光定量PCR仪及mSEPT9试剂盒测定，用对照样品ACTB(β-actin)验证PCR反应的有效性。当待测样品ACTB的Ct结果≤32.1，Septin9的Ct≤41.0时，检测结果为阳性；待测样品ACTB的Ct≤32.1，Septin9的Ct>41.0或无检出(Ct无显示)时，检测结果为阴性；如果ACTB的Ct>32.1，说明本次结果无效。依据阳性质控品原液Ct值，用阴性血浆10倍系列稀释，分装至5 mL螺口离心管中，每管4 mL，作为阳性质控品。Jurkat细胞抽提基因组DNA经阴性血浆稀释，每管4 mL，作为阴性质控品。分装完毕后，-20 ℃冻存。
1.5 均匀性评价 参照CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》中关于均匀性
的评价要求，每批质控品随机从-20 ℃各抽取10支，采用mSEPT9试剂盒检测，每支重复测定2次。
1.6 稳定性评价 模拟质控品运输时的保存条件，评价其稳定性。随机抽取-20 ℃保存的各浓度质控品6支，2～8 ℃保存，在第14天取出，用mSEPT9试剂盒检测，与-20 ℃保存时的检测结果比较。
1.7 室间质量评价 室间质评样品盘包括5支样品，其中各浓度阳性样品各1支，阴性样品1支。为保证检测结果真实性，每套样品盘的样品随机编号。样品盘经冷链运输发送给各实验室，要求其在规定时间内用实验室常规检测系统检测，结果通过网络系统上报。对回报定性结果进行评定，室间质评成绩=符合的样品数/总样品数×100，100分为成绩优秀，80～99分为成绩合格，小于80分为不合格。各实验室回报的Ct值用于分析实验室阳性样品检测结果的线性相关性。小学英语课教学反思
1.8 统计学分析 用SPSS 16.0统计软件进行。均匀性评价用单因素方差分析，稳定性评价用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
比较级的用法
2.1 血浆mSEPT9检测质控品的制备 抽提的HeLa和Jurkat基因组DNA经分光光度法检测，结果分别为：HeLa细胞，A260 nm/A280 nm=1.99，浓度为133.5 ng/μL；Jurkat细胞A260 nm/A280 nm=2.00，浓度为46.1 ng/μL，其纯度和浓度均可满足使用需求。mSEPT9试剂盒检测结果显示,HeLa基因组DNA呈典型S形扩增曲线，Jurkat基因组DNA无特异性曲线扩增，见图1。用阴性血浆10倍系列稀释HeLa基因组DNA至Ct值约为28、31、34、38，Jurkat基因组DNA至0.01 ng/μL，分别用作mSEPT9检测不同浓度阳性和阴性质控品。alternatives
图1 质控品原液荧光PCR扩增曲线图
quiet是什么意思2.2 均匀性评价 阴性质控品经检测无特异性扩增曲线，均为阴性。阳性质控品均匀性检测结果见表1，P>0.05，均匀性良好。
natasha lyonne表1 阳性质控品均匀性检测结果序号预期Ct值检测Ct值(x±s)CV(%)FP128.528.2±0.20.81.50.28231.831.4±0.20.60.40.92335.135.3±0.92.61.00.49438.438.3±0.61.50.30.98
2.3 稳定性评价 阳性质控品2～8 ℃保存14 d与-20 ℃保存，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2，说明质控品在2～8 ℃保存14 d稳定性良好，可满足质控品作为室间质评样品运输与保存的要求。
表2 阳性质控品稳定性检测的Ct值结果序号2～8 ℃保存14 d(x)-20 ℃保存(x)标准差tP128.128.20.090.55>0.05231.231.40.171.85>0.05334.734.90.470.97>0.05438.938.70.530.69>0.05
2.4 室间质量评价 9家实验室参加本次室间质评活动，均采用实时荧光PCR法。样品合格率随质控品浓度从高到低分别为100%、88.9%、100%、88.9%和88.9%。7家实验室回报结果全部符合预期，成绩优秀(100分)；1家实验室成绩合格(80分)；1家实验室成绩不合格(60分)。其中，2家实验室出现假阴性结果，1家实验室出现假阳性情况。对实验室上报Ct值进行线性回归分析显示，线性回归R2值大于0.97的仅有5家(55.6%)，见表3。
欲望都市第三季表3 mSEPT9检测室间质评结果参评实验室评价结果线性回归公式R21优秀y=3.23x-5854.90.9962优秀y=3.44x-6237.60.9963优秀y=3.71x-6725.30.9744优秀y=3.12x-5655.10.9915合格y=2.65x-4785.80.9086不合格//7优秀y=4.60x-8355.50.9218优秀y=4.37x-79360.9839优秀y=3.74x-6782.80.921
注：x,不同浓度质评样品，y,不同浓度质评样品检测Ct值；/,此参评实验室回报结果不成线性。
3 讨论
本研究利用Septin9区域不同甲基化状态细胞系(HeLa/Jurkat)抽提基因组DNA，经阴性血浆稀释制备质控品[6-7]。此质控品显著特点是可有效监测从血浆DNA提取到PCR结果分析全过程，从而充分保证检测结果准确可靠。此外，它还具有易于批量制备、价格便宜等优点。同时，性能评估结果显示质控品均匀性稳定性良好，说明其可用于室间质评活动，质评结果也进一步证实了这一点。虽然质控品评估过程仅使用1种试剂盒，但有1家参评实验室使用了其它厂家试剂盒且结果正常，表明了其临床适用性良好。然而，自制质控品也存在片段大小与循环游离DNA不完全一致的问题，因而不能完全模拟血浆游离DNA提取过程。今后研究中，我们也将采用超声打断或酶切方式处理基因组以解决上述问题，从而获得最大程度模拟临床标本的质控品。
