犜犕犈犕６７基因突变所致的Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征一家系及临床遗传学分析
李陈１ 魏然１ 王逾男１ 何薇１ 赵馨１ 丁红珂１ 杨朝湘２ 卢建１ 尹爱华１
（１．广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州 ５１００１０；２．广东省妇幼保健院医学影像科，广东广州 ５１００１０
）【摘要】 目的 利用二代测序技术结合Ｓａｎｇｅｒ测序验证对一临床诊断为Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的家系进行致病基因检测。方法 以２０１５年广东省妇幼保健院产前诊断科诊断为Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的一家系为研究对象，采集先证者胎儿病史、影像学检查结果及家族史，采用全外显子高通量测序方法，对先证者胎儿及其父母进行基因检测，后对发现的致病位点进行Ｓａｎｇｅｒ测序验证。结果 检测到先证者在犜犕犈犕６７基因第１２个外显子上发生了错义突变，ｃ．１１７５Ｃ＞Ｇ（来源于父亲），以及在ＴＭＥＭ６７基因第１２个外显子上发生了另外一个错义突变，ｃ．１２５０Ａ＞Ｇ（来源于母亲）的双重杂合改变，符合孟德尔隐性遗传。结论 本研究成功利用二代测序技术鉴定了一种导致Ｊ
ｏｕｂｅｒｔ综合征的新发突变类型，此位点为国内外首次报道，丰富了Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的病因信息。二代测序技术为产前确诊罕见疾病提供一套可行的新方法，建立基因水平上的堡垒。
【关键词】 Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征；犜犕犈犕６７基因；二代测序技术【中图分类号】 Ｒ７１４．５５ 【文献标识码】 Ａ
犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐ
ｄ．２０１９．０３．００８ 通讯作者：尹爱华，Ｅ ｍａｉｌ：ｙｉｎａｉｗａ＠ｖｉｐ
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厘米的英文．１２６．ｃｏｍ【犃犫狊狋狉犪犮狋】 犗犫犼犲犮狋犻狏犲 Ｕｓｉｎｇｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）ａｎｄＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｎｏ ｖｅｌｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｉｎａＪｏｕｂｅｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅｆａｍｉｌｙ．犕犲狋犺狅犱 ＡｆａｍｉｌｙｗｈｉｃｈｄｉａｇｎｏｓｅｄａｓＪｏｕｂｅｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅｆａｍｉｌｙｗａｓｅｎｒｏｌｌｅｄａｓｓｕｂｊｅｃｔｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｆｒｏｍｏｕｒｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓｉｎ２０１５．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅｍｅｄｉｃａｌｈｉｓｔｏｒｙ，ｉｍａｇｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｆａｍｉｌｙｈｉｓｔｏｒｙｏｆｔｈｅｓｕｆｆｅｒｉｎｇｆｅｔｕｓ，ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）ａｎｄｓａｎｇｅｒｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｓｕｆｆｅｒｉｎｇｆｅｔｕｓａｎｄｉｔｓｐａｒｅｎｔｓｔｏｄｅｔｅｃｔａｎｄｖｅｒｉｆｙｔｈｅｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｃａｕｓｉｎｇｔｈｉｓｄｉｓｅａｓｅ．犚犲狊狌犾狋狊 Ａｍｉｓｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｃ．１
１７５Ｃ＞Ｇ（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｆｒｏｍｆａｔｈｅｒ），ａｎｄａｎｏｔｈｅｒｍｉｓｓｅｎｓｅｍｕｔａ ｔｉｏｎｃ．１２５０Ａ＞Ｇ（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｆｒｏｍｆａｔｈｅｒ）ｈａｄｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅａｆｆｅｃｔｅｄｆｅｔｕｓ，ｗｈｉｃｈｈａｄｂｅｅｎｃｏｎ ｆｉｒｍｅｄｔｏａｃｃｏｒｄｗｉｔｈＭｅｎｄｅｌｉａｎｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ．犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀狊 ＷｅｆｉｒｓｔｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｄａｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅＴＭＥＭ６７，ｗｈｉｃｈｉｓａｎｏｖｅｌｍｕｔａｔｉｏｎｃａｕｓｉｎｇＪｏｕｂｅｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｔｈｉｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙｈａｄｅｎｒｉｃｈｅｄｔｈｅｇｅｎｅｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＪｏｕｂｅｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）ｐｒｏｖｉｄｅｄａｐｒａｃｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅ ｎａｔａｌｄｉａｇ
ｎｏｓｉｓｏｆｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅ．【犓犲狔狑
狅狉犱狊】 Ｊｏｕｂｅｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅ；ｇｅｎｅ犜犕犈犕６７；ＮＧＳ
Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征（ＭＩＭ２１３３００）是一种罕见的以小脑蚓部发育不良（中 后脑畸形）伴发作性呼吸过度、
眼球运动障碍、共济失调和智力低下为主要特征的神经系统发育障碍性遗传病，也常与肾脏及肝脏
等内脏发育异常相关［１］
。Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的主要遗
传方式为常染色体隐性遗传，
少部分为Ｘ连锁隐性遗传。它的典型神经影像学表现为“
磨牙征”［２］
。Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的发病率低，在活产儿中约为１／１００
０００～１／８００００［３］
。由于Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征存在临床表
现的异质性及致病基因的不明确性，Ｓａｎｇ
ｅｒ测序不
适用于Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的基因诊断。在二代测序技术（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）的推动下，全外显子高通量测序技术发展迅速，ＮＧＳ可以通过反复测序同一区域的ＤＮＡ片段，达到很高的灵敏度和准确度，同时能在很短的时间内完成上百亿碱基的测序，效率高，为基因组分析提供了新的方法［４］。本研究利用全外显子高通量测序技术对一Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征家系进行突变基因检测，并对检测到的突变位点进行Ｓａｎｇｅｒ测序验证，不仅成功鉴定了一种导致Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的新突变，丰富了Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的病因信息，同时为罕见疾病的产前诊断及临床确诊提供了一套可行的新方法。
１ 材料与方法
１．１ 病历资料 穆某某，４０岁，因“外院超声发现胎头变形、双肾增大、羊水过少”于广东省妇幼保健院产前诊断中心就诊。既往史：Ｇ５Ｐ１Ａ３，既往３次均因“胎儿双肾异常、羊水过少”引产，引产后未行进一步检查。自然流产１次，２００６年剖宫产一女婴，健存。现为第５次怀孕，２０１５年１１月１１日本院Ⅲ级超声提示：孕２５＋周，胎儿双侧多囊肾声像，严重羊水过少，Ｄａｎｄｙ Ｗａｌｋｅｒ变异型（图１）。本院ＭＲＩ提示：胎儿小脑蚓部显示不明确，轴位上中脑层面可见“臼齿征”，双侧小脑上脚增粗；第四脑室增宽扩大，并与后颅窝池相通。多拟Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征畸形改变（图２）。双侧侧脑室及后颅窝池轻度增宽，双侧婴儿型多囊肾，羊水过少。入院诊断：①胎儿异常；②羊水过少；
③遗传咨询（不良孕产史）；④高龄孕产妇妊娠监督；
祛痘的偏方
⑤瘢痕子宫。本研究家系既往无遗传病家族史，非近亲婚配，夫妇双方均体健。经遗传咨询，夫妻双方知情选择行产前诊断（羊水），行胎儿染色体分析、微阵列分析及全外显子测序检查；夫妇双方同时行外周血染色体测序分析，测序结果均经Ｓａｎｇｅｒ测序验证。测序及Ｓａｎｇｅｒ验证结果显示存在致病基因位点，夫妇双方要求引产并行胎儿尸检。本研究家系既往无遗传病家族史，非近亲婚配，夫妻双方均体健。本研究获得了广东省妇幼保健院机构审查委员会及广州医科大学伦理委员会的批准。所有样品的采集均取得了参与者的书面知情同意书
。
图１ 胎儿Ⅲ级超声图像（左图：脑部Ｄａｎｄｙ Ｗａｌｋｅｒ变异型；右图：多囊肾
）
图２ 胎儿头颅磁共振图像（小脑蚓部“臼齿征”）
１．２ 实验方法
１．２．１ 羊水及外周血ＤＮＡ提取 用ＱＩＡＧＥＮ公司基因组ＤＮＡ提取试剂盒ＱＩＡＧＥＮＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｎｉＫｉｔ按试剂盒说明书提取羊水及外周血ＤＮＡ，使用Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００超微量分光光度计进行提取ＤＮＡ的定量。
１．２．２ 羊水培养及染色体核型分析 常规操作进行羊水细胞原位培养、收获、制片和Ｇ显带，全自动扫描仪扫描、拍照。按照人类细胞遗传学国际命名体制（ＩＳＣＮ２００９）标准进行Ｇ显带染色体核型分析诊断。必要时加做Ｃ显带、Ｎ显带；
１．２．３ 羊水染色体微阵列分析及ＱＦ ＰＣＲ分析 羊水ＤＮＡ使用Ａｇｉｌｅｎｔ公司生产的的芯片进行全基因组扫描检测，数据分析参照ＤＥＣＩＰＨＥＲ、ＩＳＣＡ、０ＭＩＭ、ＤＧＶ、ＵＣＳＣ等数据库。胎儿取材母血ＤＮＡ污染鉴定结果：Ｄ１３Ｓ３０５、Ｄ１８Ｓ９７８、Ｄ２１Ｓ１１等１１个ＳＴＲ位点测序分析提示无母体ＤＮＡ污染。１．２．４ 羊水ＤＮＡ二代测序 定制罗氏Ｎｉｍ ｂｌｅＧｅｎ全外显子捕获探针对全外显子区域ＤＮＡ捕获并富集，使用ｉｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）进行高通量测序。数据分析：①基本信息分析：去接头污染，去低质量后进行原始
elf是什么意思数据产量统计；②使用ＢＷＡ比对软件，将数据与参考序列进行比对统计；③根据测序深度、突变质
量，对检测得到的ＳＮＰ进行过滤筛选，得到高质量可靠的突变谱；④筛选出的变异对蛋白功能影响的预测：使用ｓＩＦＴ、Ｐｌｏｖｐｈｅｎ ２、ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒ等基于同源比对，蛋白结构的保守性等的算法，预测筛选出的变异对蛋白质的影响。
１．２．５ Ｓａｎｇｅｒ测序 根据高通量测序结果用Ｓａｎ ｇ
ｅｒ测序对羊水细胞ＤＮＡ及父母外周血ＤＮＡ进行突变位点的检测和验证。采用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计引物，扩增犜犕犈犕６７基因第１２个外显子序列。引物序列为：ＴＭＥＭ６７ Ｅ１２Ｆ：ＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＧＧ ＴＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＣＡＴＴ，ＴＭＥＭ６７ Ｅ１２Ｒ：ＧＧＧ ＴＣＴＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴ。ＰＣＲ扩增条件为：９５℃５ｍｉｎ，９５℃３０ｓ、，５８℃３０ｓ，７２℃５ｍｉｎ、，７２℃３０ｓ，共进行３８个循环反应。２ 结果
２．１ 脐血染色体核型与染色体微阵列分析 胎儿羊水染色体及微阵列分析未见异常。
２．２ 二代测序结果分析 胎儿脐血测序及Ｓａｎｇｅｒ验证结果显示：ＴＭＥＭ６７基因第１２个外显子上发生了双重错义突变，位点分别为ｃ．１１７５Ｃ＞Ｇ及ｃ．１２５０Ａ＞Ｇ。其中ｃ．１１７５Ｃ＞Ｇ来源于父亲，ｃ．１２５０Ａ＞Ｇ来源于母亲（图３）。ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒ
根
图３ 犜犕犈犕６７基因Ｓａｎｇ
ｅｒ测序峰图Ａ、Ｂ．胎儿脐血犜犕犈犕６７基因；Ｃ．母方外周血犜犕犈犕６７基因；
Ｄ．父方外周血犜犕犈犕６７基因
据遗传方式及家系中分布情况推测该位点为疾病相关变异，相关数据库及文献未见报道。犜犕犈犕６７基因突变与Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征６型相关，为常染色体隐性遗传。临床主要表现为精神运动发育迟缓、小脑蚓部发育不良引起的共济失调、肾囊肿、视网膜发育不良等。
２．３ 引产后胎儿尸检结果分析 引产后胎儿尸检结果提示：
subdivision胎儿小脑蚓部完全缺如，心脏室间隔缺损，双肾发育不良伴多囊肾。符合胎儿Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征，符合产前诊断的结果。３ 讨论
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Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征（Ｊｏｕｂｅｒｔｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＪＢＴＳ，２１３３００）是一种常染色体隐性遗传病，以小脑蚓部发育不全为特征，伴有低张力、发育迟缓、呼吸模式异常和眼球运动异常。枕叶脑膨出和多指畸形偶有报
道。临床上Ｂｒａｎｃａｔｉ等人［５］
将Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征是否
合并其他异常分为６型，即单纯型Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征、Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征合并眼部异常、Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征合并肾脏异常、Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征合并眼肾异常、Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征合并肝脏异常、Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征合并口面指畸形。目前遗传学上根据致病基因不同又将Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征分为３５种，犜犕犈犕６７基因异常导致的Ｊｏｕ ｂｅｒｔ综合征属于基因分型Ｊ
ＢＳＴ６型，约占Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的６％～１０％［６］。
本文我们描述了一对非近亲婚配的夫妇，共怀过４次产前超声异常的胎儿。前三胎均在外院行产前检查，提示有“双肾增大、羊水过少”，未行染色体及基因检测。第５胎在本院产前超声诊断为脑部Ｄａｎｄｙ Ｗａｌｋｅｒ变异型及双侧多囊肾声像、严重羊水过少，胎儿脑部ＭＲＩ见特征性“臼齿征”，怀疑Ｊｏｕ ｂｅｒｔ综合征。当产前超声及ＭＲＩ发现胎儿结构异常时我们首选染色体核型及微阵列技术检测，因此本文中进行了羊水核型及微阵列检测，结果均为正常。同时根据胎儿特征性Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征可疑脑部异常征象，
我们进行了羊水全外显子测序，发现了一种犜犕犈犕６７基因的新型双重杂合突变（ｃ．１１７５Ｃ＞Ｇ及ｃ．１２５０Ａ＞Ｇ），且这两种杂合突变分别遗传自父母，同时表型正常的大女儿仅为杂合子。这两种
杂合突变类型均未被报道过，且此两个变异位点均可引起编码氨基酸的改变。结合该病遗传特性、受检胎儿临床资料及家系基因检测结果，强烈提示两个变异位点为疾病相关变异［７］。因此，我们考虑犜犕犈犕６７基因的双重杂合突变（ｃ．１１７５Ｃ＞Ｇ及ｃ．１２５０Ａ＞Ｇ）为异常胎儿的致病原因。
osmotics基因犜犕犈犕６７（ＮＣ＿０００００８．１１）位于染色体８ｑ２１．１３ ｑ２２．１位置，全长约１２．６７Ｍｂ，由Ｓｍｉｔｈ［８］２００６年在大鼠中发现。人犜犕犈犕６７基因编码一种由９９５个氨基酸组成的蛋白质，称为Ｍｅｃｋｅｌｉｎ蛋白，蛋白质量约１０８ＫＤ，与大鼠Ｍｅｃｋｅｌｉｎ蛋白有８４％的同源性。２００７年Ｂａａｌａ等人［９］首次在一个近亲家庭中发现犜犕犈犕６７基因异常导致的ＪＢＳＴ６，这个家庭两次妊娠都因“超声发现胎儿后颅窝异常及肾脏”增大于孕晚期引产，夫妇双方携带了两种不同的犜犕犈犕６７基因突变并遗传给胎儿。后Ｄａｗｅ等人［１０］２００７年利用原位杂交技术在人类胚胎中发现，Ｍｅｃｋｅｌｉｎ蛋白在肾、肝、视网膜、后脑、蝶骨和脑中线均有表达。在发育中的肢体软骨中也有很强的表达，尤其是在指（趾）软骨中。同时他们利用免疫组化技术发现，１８～２０周龄人胎儿肾脏在近端肾小管上皮细胞中检测到中等至高表达的Ｍｅｃｋｅｌｉｎ蛋白。
犜犕犈犕６７基因缺陷可导致多种综合征，包括ＲＨＹＮＳ综合征、ＣＯＡＣＨ综合征，Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征６型（ＪＢＳＴ６），Ｍｅｃｋｅｌ Ｂｒｕｂｅｒ综合征３型（ＭＫＳ３），Ｂａｒｄｅ
ｔ Ｂｉｅｄｌ综合征１４型等。由犜犕犈犕６７基因异常导致的ＪＢＳＴ６型往往伴有视网膜营养不良与肾脏异常。２００９年Ｏｔｔｏ等人［１１］在１２０例无血缘关系ＪＢＳＴ患者中发现４例（３．３％）为犜犕犈犕６７突变引起。４例患者均有共济失调、低张力或精神运动迟缓或小脑蚓部发育不良。且４例患者均在８～１５岁期间出现终末期肾病、肝纤维化，同时也有眼部受累，包括失明、视网膜退行性变或视网膜色素瘤。２０１３年ＤｕＥ等人［１２］研究表明，犜犕犈犕６７基因可通过激活ＥＲＫ和ＪＮＫ依赖的信号通路导致肾脏疾病的发生。本文中胎儿出现的主要表现为典型的ＪＢＳＴ表现脑部“臼齿征”及肾脏异常改变，符合犜犕犈犕６７基因异常引起的ＪＢＳＴ６型特征。
通过二代测序技术，我们发现了疾病相关的异常基因改变。随着基因技术的发展，产前诊断越来越多地采用更先进的分子遗传学检测技术，如ＣＭＡ和ＮＧＳ。２０１８年，ＩＳＰＤＳＭＦＭ和ＰＱＦ就基因测序用于胎儿诊断发表了联合声明，内容包括：对于ＣＭＡ等公认检测方法无法提供有效信息的胎儿，目前可采用测序诊断技术进行胎儿评估［１３］。与该声明一致，我们首先采用染色体核型和ＣＭＡ辅助产前诊断，最终通过二代测序技术确认了犜犕犈犕６７的新发复合杂合突变为致病原因。本文表明二代测序技术是对产前诊断十分有帮助和有效的检查，特别是对于临床鉴别诊断模糊的胎儿。为ＮＧＳ应用于产前诊断的适用性提供了有力证据。同时，此犜犕犈犕６７的复合杂合突变为首次发现且与ＪＢＳＴ６相关，这不仅帮助家庭确定和避免未来妊娠的复发风险，同时更对这种罕见疾病提供了更多的基因诊断信息和有更深刻的了解。
综上所述，我们利用二代测序技术首次发现了一种犜犕犈犕６７新发复合突变（ｃ．１１７５Ｃ＞Ｇ合并ｃ．１２５０Ａ＞Ｇ），并且根据基因检测结果及基因型 表型分析，确认此突变为上文所述家系的遗传学病因。后我们的研究表明，二代测序技术是一个能够有助于诊断胎儿产前超声检查异常的遗传学病因的有效技术。在成功找到遗传学病因后，可在下一次生育实现妊娠早期产前诊断及知情选择ＰＧＤ有效避免罕见遗传病的发生。同时我们发现了Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的一种新发复合突变，丰富了Ｊｏｕｂｅｒｔ综合征的基因信息。
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ＰｏｓｉｔｉｏｎＳｔａｔｅｍｅｎｔｆｒｏｍｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＰｒｅｎａｔａｌ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（ＩＳＰＤ），ｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭａｔｅｒｎａｌＦｅｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ
留学准备（ＳＭＦＭ），ａｎｄｔｈｅＰｅｒｉｎａｔａｌＱｕａｌｉｔｙＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＱＦ）ｏｎ
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withorwithoutyou
（收稿日期：２０１９ ０７ ２９）
编辑：宋文颖
