-1704•中国药理学通报Chiee Pharmncologicnl Bulletin2024Dec；36(12)：D44〜9
网络出版时间：2420-10-41)：17网络出版地址：https：//O/s.ckk/xemkcms/Ow/W34.D86.a.24201242.1517.436.html
槲皮素对大鼠皮层神经元的雌激素样作用研究
甄艳杰，刘靓靓，赵雨薇，钟明，沈丽霞
(河北北方学院药学系，河北省神经药理学重点实验室，河北张家口475004)
OoRD.1665/ji issx.144)-10760020.10.424
文献标志码：A文章编号：D4)-1973(2420)17-1744-46中国图书分类号:RG32；R322.81；R336)；R745.7；R977.12摘要：目的研究槲皮素(que/eUx,Que)对雌激素耗竭条件下原代培养的初生大鼠皮层神经元细胞的雌激素样保护作用及其机制。方法取新生24h内SD大鼠的皮层神经元进行原代培养，经MTT法和免疫荧光染色实验观察槲皮素对细胞活力和形态的影响；通过Western UWt方法检测槲皮素对皮层神经元中雌激素受体a(ER a)、雌激素受体B (ERp)表达量，以及加入雌激素受体拮抗剂(ICI139,784)的影响。结果MTT结果和免疫荧光染色显示,Quc(54J04 p moi•L-)组可提高皮层神经元的活性(P<4.45)，神经元细胞明显促进突触形成，大部分神经元胞体饱满；突触数目明显增多(P<4.45-；Western UWt结果显
minus怎么读
示，Que(54、、04 p moi•L7)组细胞的ER a蛋白的表达量明显提高,ER|3蛋白表达的影响并不明显，且ICR82,784可以拮抗槲皮素对于神经元的保护作用。结论槲皮素对原代培养的初生大鼠皮层神经元细胞发挥保护作用，可能是与ER a介导有关。
关键词：槲皮素；阿尔茨海默症；雌激素；雌激素受体；皮层神经元细胞；植物雌激素
阿尔茨海默病(AWheioer's dia,AD-属于一种典型的中枢神经系统退行性疾病，临床表现为进行性的记忆的减退以及认知功能的损害3］。目前认为AD有两个比较明显的病理学特征：由0-淀粉样蛋白(amyloid-2p/teix,A0)沉积形成的老年斑(ohe playues)在大脑皮层和海马神经元细胞外大量出现；由神经元细胞内高度磷酸化的tan蛋白
收稿日期：2929-08-15，修回日期：2727-16-10
基金项目：河北省自然科学基金资助项目(No H2917495057-；河北省高等学校科学技术研究项目(No ZD2929156)；河北省
拼搏的英文
研究生创新项目(No CXZZSS27D147)
作者简介：甄艳杰(D73--，女，硕士生，研究方向：神经药理学,E-mail:；
沈丽霞(1270--，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：
神经药理学，通讯作者，E-mail: 所导致的神经纤维缠结(nep/fiPrillarg tanylvs［。而研究发现AD最终都表现着相同的病理改变，即大脑皮层、海马、额颞叶中的神经元突触大量缺失和神经元的细胞凋亡，这些神经元突触和神经细胞与认知功能密切相关3］。由于其发病机制尚不清楚，目前临床治疗药物只能短期改善症状，而不能阻止或延缓疾病的进展，因此寻找能够治疗AD的有效药物是当前亟待解决的难点。
雌激素对大脑中神经元有明确的保护作用，可对抗A0诱导的神经退行性病变^-1，雌二醇可通过上调Bcl-6mRNA的表达以及下调Bue mRNA的表达从而减少A025G7对PC17细胞的神经毒性3o 女性进入绝经期后，体内雌激素水平明显下降，长期以来临床采用人工合成的雌激素替代治疗(est/pex repincemepi treatmeol：ERT-，使患阿尔茨海默病危险下降50%o然而ERT所带来的如生殖系统肿瘤及乳腺癌的发生等不良反应影响其推广应用。人们致力于寻求雌激素的替代物，期望这种替代物能保留雌激素的保护作用，同时避免上述的不良影响，来源于植物而且结构类似雌激素的植物雌激素(phy-toest/yeo)正是其中的重要一类，有望成为预防和治疗AD的雌激素替代物。如金雀异黄素(uenktein, Gen)可通过与胞膜胞内的雌激素受体(est/pex/-ceptor,ER)结合从而发挥神经保护作用，可以明显提高A071G5损伤后的皮层神经元活性，并减少彗星细胞的数量及其拖尾长度J］o
雷锋演讲稿槲皮素(quercetin,Quo-属天然黄酮类物质，与雌激素有着相似的化学结构，具有雌激素样作用。目前已有研究发现，槲皮素可以减少SH-5Y5Y细胞中淀粉样前体蛋白(amyOid p/cursor protein-的成熟，可
以减少AD模型大鼠中A0所占的比例。课题组前期研究表明，槲皮素可通过经典的ER途径，影响PR IKAkt/GSKE0信号通路的激活，并且对A025G5诱导的PCD细胞的损伤具有类雌激素样神经保护作用J］o本研究将从槲皮素对大鼠皮层神经元细胞的保护作用入手，对槲皮素介导雌激素受体途径影响大皮层神经元进行研究。同时利用ER 完全拮抗剂，进一步探索槲皮素发挥神经保护作用
中国药理学通报CCOe Pharmacological Bugetin2420Dec；33(12)-1745•
的相关途径，并为神经系统疾病药物的开发提供新的思路和策略，从而探索植物雌激素能够替代雌激素作为未来参与治疗AD药物的可行性。
9材料与方法
16材料c span
1.1.1动物Shranue Dawley（SD）大鼠，许可证号：SYXK（京）2714U739，新生24h内的SD大鼠（乳鼠）
1.1.0药物与试剂槲皮素（中国药品生物制品检定研究所，批号：120261-727979）、金雀异黄素（中国药品生物制品检定研究所，批号：21704-201302）、170-雌二醇（adcum公司，批号：APN11762-1-1）、ER完全拮抗剂（I CR82,780,aLcam 公司，批号：APN07104UU）5NenyPasai-N Medium 培养基（Gibco公司，批号：1645623）、B-27Supple-mex》50x）（Gibco公司，批号：1774487）、DMEM/高糖培养基（HyCmve公司，批号：SH30284.01）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号: 22150715）、MTT（Sigma公司，批号：MKBS4732V）、Nenuvai Class皿p-TubuPn（Tuj1）抗体（碧云天生物技术公司）、CyTM3uonjupated Affinipure Govt An-ii-Mousa IgG（Jochsov Immuna Renrch公司，批号: 171367）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗IGG（H +L）（Novus BUmgUals公司，批号：4103945）、p-ac-tiv（Santa Cua公司，批号：C2014）、ERp抗体（Novus BUmgUals公司，批号：2100-1Pl40975）、ER a抗体（Novus BUmgUals公司，批号：2100-SPl40905）sneaker是什么意思
1.1.0仪器C02培养箱（Therma公司），超速冷冻离心机（SUmn公司），荧光倒置显微镜（Nikov公司），体视学显微镜（LeUv公司），多功能酶标仪I Tecun公司），化学发光凝胶成像系统I PuteinSim-pia公司）。
162方法
1.2.6大鼠皮层神经元的原代培养在低温条件下取乳鼠的大脑皮层组织，小心剥去脑膜及血管，剪碎成小块，大小为1mm5左右，加入0.125%的胰蛋白酶，加入离心管中，在37°C水浴17m/o用含17%胎牛血清的高糖培养基终止消化，离心除去上清，重复上述操作两次。加入培养基吹散，通过220目筛，预先用多聚赖氨酸包被培养板，而后将细胞悬液移入包被完成的培养板中，并在87C,0%CO0培养箱中孵育培养,6h后，将培养基改为Nenux-basal+B27的神经元专用无血清无酚红培养基，继续在此培养基中培养。培养60后，通过免疫荧光染色法鉴定神经元纯度。将培养至40的细胞用
T-1抗体和DAPI进行标记，倒置显微镜下观察，镜下可见所有细胞核均发出蓝色荧光，而T-1阳性细胞则显示红色荧光，将两图进行重叠可计算出神经元细胞所占的比例，将计算出的比例用作神经元细胞的纯度。
1.2.0MTT检测槲皮素对神经元细胞活性的影响
以合适的细胞密度在包被后的97孔板中接种皮层神经元细胞，培养50后，按如下分组加入不同的含药培养基继续培养24h,DMS0空白对照组（体积含量比不超过0.2%）、17p-E2阳性药对照组（0.02 j mot•Lr'Gex阳性药对照组（25j mot•L-）、Que低剂量组（50j mot•L-）、Quo中剂量组（170 jmot•L-）、Que高剂量组（200jmot•1），每组设置6个复孔。同时完全拮抗ER的皮层神经元细胞模型，
以检测槲皮素对完全拮抗ER的皮层神经元细胞活性的影响，在药物干预前每孔加入ER完全拮抗剂31182,780（每孔中的ICR82,780终浓度为1j mot•L-），置于87C,5%CO0培养箱中孵育2h o孵育完成后弃去板中含拮抗剂的培养基，并按依次加入上述含药培养基，每组设置6个复孔，每孔加入170j L含药培养基，继续培养24h和43h o 采用MTT法测定0D值并计算细胞存活率（实验组0D值/DMSO空白对照组0D值x170%,suuUal rata,SR）。
1.2.0免疫荧光检测槲皮素对神经元细胞形态的影响在包被后的24孔板将皮层神经元接种后培养6d，按照以下不同的分组添加不同的含药培养基继续培养24/DMS0空白对照组（体积含量比不超过0.1%）、17p-E2阳性药对照组（0.02j mot•L-）、Gen阳性药对照组（25j mot•L-）、Que低剂量组（50j mot•L"）、Quo中剂量组（100j mot•L-）、Que高剂量组（200j mot•L-）。培养24h后弃去培养基，加入新鲜配制的4%多聚甲醛在室温下固定36min，用体积分数为0.2%的T/tovX-100在室温下进行透化处理22min，使用0%的牛血清白蛋白圭封闭30min，将稀释后的Tujl抗体加入孔板中，并在4C下孵育过夜，再加入荧光二抗（CyTM3-conjupated dWUipuu goni anti-m o v s o RG,:800PBS 稀释），于暗盒中在室温条件下孵育1h o去除移去荧光二抗，滴加完成稀释的DAPI染色工作液（1: 82PBS稀释），于暗盒避光对细胞核进行复染17 m/o在荧光倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照采集图像，采集的图像使用Image-Lra Plus软件进行分析处理。
1.2.0Westeu Ulai检测槲皮素对神经元细胞ER
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蛋白表达的影响将皮层神经元细胞接种在包被后的4孔板中培养6d o根据“1.2.2”中的实验组，添加不同含药培养基，培养29h o收集培养后的细胞，添加细胞裂解液，置于冰上，裂解36min，用移液枪不断吹打以确保细胞充分裂解,4^,17000a•min-离心7miP o用BCA法测定蛋白含量，裂解液调整蛋白浓度，使各不同分组的蛋白浓度一致，按9 :1的比例混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液，在47°C金属浴中D min，以确保蛋白充分变性。确保每孔蛋白上样量22-27po，使用10%SDS-BAGE凝胶进行蛋白分离，转膜,5%脱脂牛奶封闭2h后，加入一抗0440x(1:500)J雌激素受体a/0—抗(1 :300),4C孵育过夜。第二天将膜用TBST洗3次，每次洗17min。室温孵育二抗(Goat anti-mou RG/HRP0：9000)2h o用TBST将膜清洗3次，每次清洗17min，发光，拍照，成像，分析条带灰度。
12统计学分析本实验数据以p±s表示，使用SPSS15.0对实验数据进行统计学分析，多组间采用单因素方差分析(One-Aay ANOVA)比较，两组样本间采用i检验比较。
2结果
2.1原代培养皮层神经元细胞纯度神经元培养5O后，神经细胞生长较好，细胞突触进一步伸长和增粗，具有双极、多极突起，并交织成网络；在培养5 O后，细胞体较大，周围可见明显光晕，细胞突触延长、增粗且分支较多，突触间、突触与胞体之间联系增多，形成密集的神经网络；培养4O后，神
经元细胞开始退化，大量细胞体团聚成簇，且折光性降低，突触减少、缩短，以及胞质内空泡或颗粒增多；结果显示培养7-5O的细胞处于最佳状态，可将其用于后续试验。用Tujl抗体和DAPI进行标记后，随机选取4个视野中Tujl阳性神经元细胞的数目占总细胞的比例，显示培养的细胞中神经元纯度在47%左右。
22槲皮素对大鼠皮层神经元细胞活性的影响与溶剂对照组相比,170-02(0.02p moi•LJ-Geo (27p moi•L-1)处理细胞29h、48h时可以提高大鼠皮层神经元细胞的活性，且差异有统计学意义(P <2.07)；而与170-02(0.02pnoi•L-1)^6x(27 p moi•L_i-相似，Que浓度为50p moi•L-、D0 p mh•L-时，在处理29h、48h后也可以明显提高皮层神经元的活性，差异有显著性(P<0.01)，而Quo(220pmoi•L一1)组仅在药物干预29h时才可提高皮层神经元的细胞活性，并且差异有统计学意义(P<0.05)(Tab1-。不同浓度的Que对大鼠皮层神经元的活性有不同的影响，通过组间两两比较发现Que(50、170p moi•L-)处理组的大鼠皮层神经元的细胞活性均高于Que(220p mh•L-)处理组(P<0.07)，而Quo(50p moi•L-1)和Que(D0 p mh•L")两组之间仅在药物进行干预48h时才会显示出差异具有统计学意义(P<0.05)(Tab1)o 使用101152,787拮抗剂孵育后，再使用药物干预，发现孵育组与未孵育组比较,170-E2(0.02p mh•L")、Gen(25p moi•L一1-、Que(50、D0p moi•L-、220p moi•L-)，神经元活性存在明显差异(P <0-07-(Tab23)，皮层神经元细胞活性的影响均可被101152,587完全拮抗。但是溶剂对照组与使用拮抗剂的对照组相比差异无显著性(Tab2、3)o
Tab1Effect of Que oc activity of crrticai ceerecs(±1,n-6-TreatmeoP
p mol•L1
1e48e
OD SR/%OD SR/% Control0.4460±0.23)104.2 4.137)±4.4348144.2
E20.420.7366±0.413)107.04** 4.2103±4.4136117.0)* Gen250.7239±0.022107.65** 4.42))±4.27808.17** Que500.73)0±0.1/5140.17**# 4.4348±4.2D2107.00**## Que12 4.7374±4234107.65**# 4.2259±4.2165134.04**##△Que22 4.7222±4276143.00* 4.132±4.236148.0) *P<0.27,**P<0.2)es couPol；#P<0.27,##P<0.0)es Que(200 p mol•L_1-,△P<0.07es Que50p mol•L_1
Tab2Effect of Que treytmeet for24h oc activity of
actaa°cnt estregee0(0x10in crrticai ceerecs
(positive crctrei greup:17[J-1stradicl)(2±s,n=6) *P<0.47**P<0.4)es/ox-ax/gouisho y/up
T/atmeni/
p mol•L1
IPI p/PeaPeot No p/PeaPeot
OD SR/%OD SR/% Coxtrol0.42/3±0.2099102.22 2.4272±2.2D9102.42
E24.420.2/77±0.2D8109.14** 2.2732±2.216)10).23 Que52 2.4527±2.4122110.07** 2.48)3±2.422)105.0) Que D2 2.4735±2.2D814).03* 2.4522±2.4185109.77 Que202 2.457)±2.41))110.28 2.4732±2.2D914).1)
Tab3Effect oO Que treatment for24h oc activity oO
actaa°cnt estregee receptor in crrticai ceerecs
(positiw crctrei greup:geeistein)(±1,n-6) *P<0.07,**P<0.4)vs uox-ax/gouisho y/up
TreatmeoP
p moi•L1
IPI p/PeaPeot No prePeaPeot
OD SR/%OD SR/% Coxtrol0.2225±0.2D7102.22 2.43)2±2.2097102.42 Gen250.2229±0.2D5102.13** 2.4329±2.4275122.43 Que52 2.2/79±2.4128114.13**0.4338±0.4)77122.07 Que D2 2.2072±2.2D811).14**0.12)9±2.2209136.43 Que202 2.4239±2.42)9102.79* 2.2397±2.249)127.12
22槲皮素对大鼠皮层神经元细胞形态的影响melody
中国药理学通报CCine Phannncolopicn-Bulletin2020Dec；36(14)-277•
与对照组相比，用16p A2(4.42p mai•L")、Gen (25p mai•L")、Que(54、144p mai•L")处理过的大鼠皮层神经元细胞的突触数目明显增多(P< 4.45)(Fig6)，从图片上可看出，和对照组相比, 16--82(4.42p mai•L「6)、Gen(25p mai•L")、Que(54、104p mai•L")组中神经元细胞的生长状态较好，细胞突触明显增粗且分支较多，并且突触间、突触与胞体之间联系更加紧密；当分别与101182,784共同孵育时，67p A2(4.02p mai•L「6)、Gen(25p mai•L"-、Que(54、104p mai•L「6)对皮层神经元突触的促生长作用减弱，突触数量明显减少(P<4.45)(Fig2)，突触明显变细，并且突触间的连接变少。
Control E2
Fig6Nendto outorawtO ot codichi nenrans trexteP wOO
E.(2.02pmoi•L_1),Gen(25pmoi•L_1)and
Que(55pmoi•L_1,162pmoi•L_1and
ntt222pmoi•L_1)for24h
A：Reprentative phomgraph of morpyoloyg of cortical henrons immunostained for-皿-tuPuPn anh DAP1respectively(merged imqco,X 440)；B：Quantification of nenrite outprowth after UiOereni treatmeni；*P <2.45,**P<2.46ee control；；P<2.45,##P<0.21ee Que(200 pmoi•L_1)；
A ici+e2
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p工程部工作制度
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Fig2Nenrite outorawtO o C chdichi nenrans trexteP with
E.(2.02pmoi•L_1),Gen(25pmoi•L_1)and
Que(55pmoi•L_1,162pmoi•L_1and
202pmoi•L_1)for24h with or withouS
pre-inchbateP with ICI182,780for2h
A；Reprentative phomqraphg of morpyoloyg of cortical henrons immunostained for p皿-tuPubn anh DAPI respectively(merged imayvo,X 440)；B：Histopram of nenrite outprowth after UiRereni treatmeni；*P< 2.45,**P<2.46ee control.
H槲皮素对大鼠皮层神经元ER表达量的影响0-actio作为内参蛋白，与对照组相比,670-E2 (4.42p mai•L")、Gen(25p mai•L「6)、Que(54 p mal•L「6、144p mai•L「6)处理组均能上调大鼠皮层神经元细胞ER a蛋白水平(P<4.45)，而对ER-蛋白表达的影响并不明显(Fig3)。当用ILI182,784孵育后，与未孵育组比较，2-A/ (4.42 p mai•L「6)、Gen(25p mai•L"-、Que(54、104 p mai•L")ER a蛋白表达表达被拮抗，未见明显上调(Fig4)。
6讨论
随着我国人口老龄化，罹患AD的老年患者日渐增多，AD
的主要病理症是多种原因导致的神经
• 1746 •
中国药理学通报 Chine Phomncologicnl BuUePn 2020 Dec ；36( 10)
Control E 2 Que 50 Que 100 Que 200 Gen
8
6
4
2
o o o.o o. B (u g o e e q 出w a Ehelp me
巴
U O.S S U J d x 。
q H w P U &
a a w
I I ERa expression I^WI ERB expression
Control E 2 Gen Que 50 Que 100 Que 200
Fa 6 Protem abundances of ERa and ERp a carCcai
neprons trented with E 2 (0. 02 pmoi • L _0),
Gen (25 pmoi • L _0) and Que (50 pmoi • L _0,
10
。
pmoi • L _0 and
鸟。。
pmoi • L _0) for 24 h (( ±-, n = 3)
A. Western /lot of ERa and ER0.
B. Quantification of expussUn
leveir of ERa and ER0 Uy Vando Vensity analysis using Imaae J. * P <
0. 25 , * * P < 0. 21 er covtui.
FO 4 Proteia abundances oO ERa io carticai neuroiis
trented with E 2 (0. 03 pmoi • L _0) , Gen (25 pmoi • L _0) and
Que (50 pmoi • L _0, pmoi • L _0 and 20
。
pmoi • L _0)
for 24 h with or withouC prr-incybated with
ICI103,730 for 2 h (土-, n =3)
A : Western blot of ERa ;
B : Quantification of Oistogram of ERa
/and Vensity analyzed Uy Imaae J. * P <0. 05 , * * P < 0. 21 er coutu/
元的损伤，因此对于神经元细胞的保护就显得非常
重要。新生SD 大鼠皮层神经元细胞的原代培养已 被作为神经系统疾病的细胞模型⑻，为探索神经系 统疾病的发病机理及药物筛选提供了良好的平台。
大鼠皮层神经元细胞在培养至U0-6时生长状态最
佳；培养皮层神经元细胞时使用不含酚红的培养基,
即培养基中不存在酚红等具有雌激素样作用的物
质，因此，可以确保培养0-6 U 的皮质神经元细胞 可以保存在雌激素耗竭状态;T-1是一种微管蛋 白，广泛存在于细胞骨架中，其主要的功能是参与神 经元细胞类型特异性的分化,T-1抗体广泛用于鉴
定神经元细胞的标记物J]o 原代培养的皮层神经 元的特异性及纯度通过免疫荧光实验进行检测，其
纯度高达70% o
槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，其化学结 构和雌激素极其相似，是植物雌激素的一种，可从多 种食物和植物中提取，而无明显毒性和不良反应。
近年来研究显示槲皮素作为一种植物雌激素同样具
有神经元保护作用，可明显改善神经退行性病变动 物的记忆和行为能力：14_12 o MTT 实验结果显示槲 皮素在一定的剂量范围内可以提高大鼠皮层神经元
细胞的活性，初步验证了槲皮素的神经元保护作用。 通过观察皮层神经元突触的数目，结果显示槲皮素
可以明显促进皮层神经元生长，增加皮层神经元的bluebeard
突触密度，并可见不同形态的突触结构，这与170- E2,Ge2的神经元保护作用作用相类似。目前研究
发现植物雌激素主要通过与ERs 结合发挥雌激素
样作用[4]o ICR32,780作为实验用ER 完全拮抗 剂，可以完全阻断雌激素等具有雌激素样作用的物 质通过ER 介导的生物学活性，在MTT 实验中，当 使用ICR64,780孵育后，槲皮素对大鼠皮层神经元 的保护作用明显被抑制，同时也可抑制17072，金
雀异黄素的神经元保护作用。Western blot 结果显 示槲皮素可以明显提高ER a 的蛋白表达，而对于
ER0，槲皮素和对照组的蛋白表达量之间差异无显 著性；而在使用ICR32,780孵育后ER a 蛋白的表达
量明显少于未孵育组。表明槲皮素具有一定的雌激
素样作用，且对皮层神经元的保护作用可能主要是
由ER a 介导的。
参考文献：
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