DGGE和qPCR联用定量分析环境样品中优势菌群
付小花;李艳丽;乐毅全;王磊
【摘 要】It is very important to precily quantify the microbial groups in environmental samples for clarifying the functions and effects of microbes during the bio-treatment and bioremediation process in degenerated environment. In this work, a method was developed to quantify the dominant microbial group through the DGGE plus quantitative PCR techniques. Firstly, the 16S Rdna was analyzed by PCR-DGGE after the total DNA was extracted from the environmental samples to identify the dominant bacteria; condly, primers could be designed according to the gene quence of the dominant microbial groups, which could lead to quantitative results of dominant microbial groups after quantitative PCR analysis. The method demonstrates high nsitivity and ideal reproducibility; in addition, it does not need a cultivating process, which could remain the original community information at the greatest degree.%精确定量环境样品中特定微生物类群的数量对阐明环境生物治理/修复过程中微生物的功能和效应具有重要意义.该文以土壤
样品为例,将PCR-DGGE技术与定量PCR(qPCR)技术联用,定量检测样品中优势微生物类群数量.方法:抽提样品DNA,针对16S rDNA进行PCR-DGGE分析,明确样品中的优势菌群；再根据特定优势菌群的基因序列设计适合的定量引物,通过针对特定优势菌群的定量PCR分析,得到样品中优势菌群的数量信息.该方法灵敏度高、重复性好,并且无需培养,最大限度地保持了样品原始群落信息.
【期刊名称】《实验技术与管理》
【年(卷),期】2012(029)009
【总页数】4页(P45-47,50)
【关键词】优势菌群;定量检测;DGGE;定量PCR(qPCR)
【作 者】付小花;李艳丽;乐毅全;王磊
【作者单位】同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室,环境科学与工程学院,上海200092;上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室,上海200062;同济大学海洋地质国家
重点实验室,上海200092;同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室,环境科学与工程学院,上海200092;同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室,环境科学与工程学院,上海200092
【正文语种】中 文
【中图分类】X172
Abstract：It is very important to precily quantify the microbial groups in environmental samples for clarifying the functions and effects of microbes during the bio-treatment and bioremediation process in degenerated environment.In this work，a method was developed to quantify the dominant microbial group through the DGGE plus quantitative PCR techniques.Firstly，the 16SrDNA was analyzed by PCR-DGGE after the total DNA was extracted from the environmental samples to identify the dominant bacteria；condly，primers could be designed according to the gene quence of the dominant microbial groups，which could lead to quantitative results of dominant microbial groups after quantitative PCR analysis.The method demonstrates high nsitivity and ideal repro
ducibility；in addition，it does not need a cultivating process，which could remain the original community information at the greatest degree.
Key words：dominant bacteria；quantitatively monitoring；DGGE technology；quantitative PCR（qPCR）
在环境治理中，利用微生物作用的生化法因其投资少、处理效率高、运行成本低、二次污染少等优点而得到越来越广泛的应用［1］。环境治理，尤其是废水（污水）生物处理离不开微生物的作用，处理过程中各种功能的显现都有赖于具有该功能的微生物的富集。动态监测这些功能微生物的变化情况、掌握主要功能菌（或者优势菌）的微生物群落结构及微生物多样性，探讨微生物数量和结构，对反应器效能的影响及进一步提升处理装置的效能具有重要的理论指导意义。
常规的培养法无法获得样品菌群的全面信息，因为自然界中约90%的微生物不能人工培养［2］，并且人工培养后微生物群落结构与原始群落结构差异显著［3］。基于分子生物学技术的PCR-DGGE技术无需培养，直接从样品中提取微生物群落的基因组DNA，用对大多数细菌和古细菌的16SrDNA（原核微生物）基因都能有效扩增的引物进行PCR扩增，然后
对PCR产物采用DGGE分离，通过对DGGE指纹图谱分析可以了解微生物种类多样性、种群结构及相对丰度等信息。该技术已广泛应用于土壤、水体、食品、活性污泥中的微生物群落多样性的研究和微生物群体动态的追踪研究［4］。然而，DGGE指纹图谱并不能精确定量某种特定微生物类群的含量，而定量PCR（qPCR）能准确定量特定类群微生物的数量，此方法最低可以检测到1～10个拷贝的质粒DNA以及100 CFU/mL的微生物量［5］，具有灵敏性高、精确性好、特异性强和安全快速等优点，已广泛用于环境样品的检测中。
将PCR-DGGE技术与qPCR技术联用，不仅可以了解样品中的优势菌群种类，还可以根据已知的序列信息设计引物，最终得到与所需功能密切相关的微生物类群的具体微生物量及特定种类微生物在整个区系中所占的比例。这对于开展环境治理的机理研究，开发高效处理某种污染物的生物制剂等很有价值。将PCR-DGGE技术与qPCR联用来准确定量环境样品中某一种特定类群微生物含量的方法鲜见报道。我们尝试将PCR-DGGE技术与qPCR技术联用，对环境样品中的优势微生物类群进行定量测定，建立了一整套的研究方法，获得了良好的分析结果。
PCR仪（ABI Veritti 96well），台式高速离心机（Thermo Hearus Pico17），紫外与可见
凝胶分析仪（上海复日FR-980A），定量PCR仪（Rotor Gene 3000），微量移液器（Gilson），D-code System（Bio-Rad）
环境样品总DNA的提取用美国MP公司的Fast DNA Spin Kit，按试剂盒说明操作。
参照Bosshard［6］的方法进行。细菌通用引物序列如下：8f：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和 1492r：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’，产生相应于大肠杆菌（Escherichiacoli）16SrDNA序列核苷酸位置8到1 492的PCR产物。25μL PCR反应体系中，包括：2.5μL的10×PCR反应缓冲液，1μL dNTP（2.5mmol each），1UTaq酶，各0.5μL、10μmol的上下游引物，DNA 模板约50 ng。PCR 反应条件：94 ℃、3min；94℃、30s，55 ℃、30s，72 ℃、80s，30个循环；72 ℃延伸5min。PCR产物置于 -20℃下保存备用，作为16SrDNA V3区片断的模板。
采用细菌16SrDNA V3区的通用引物341f：5’-CTAGGGGAGGCAGCAG-3’和 534r：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，在341f引物前加 GC夹子，序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC，以全长序列的扩增产物稀释100倍作为模板。反应体系同上，反应条件为：94 ℃、3min；94 ℃、30s，56
℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃延伸5min。
DGGE电泳采用10%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为35%～55%（100%变性相当于7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺），每泳道上样约800ng的V3区PCR产物，电泳条件为：60℃，120V，1×TAE，7h。电泳完成后用SDNA-Nucleic Acids Stain Dye于水平摇床振荡染色30min后拍照保存，并选择有代表性的条带割胶测序。
以测序结果中的优势菌的特异序列为引物，对原样品DNA进行扩增。PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体中，挑单克隆测序，测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对以确定引物特异性，转化子保种备用。将该转化子转接于3mL LB液体培养基中培养12～16h，抽提质粒，并用Picogreen dsDNA定量试剂盒测定质粒浓度［7］，按下式计算其拷贝数：
式中，nDNA表示拷贝数，mDNA为 DNA 质量，MDNA为DNA分子量。
用已知拷贝数的质粒作为标准制作定量标准曲线。将质粒梯度稀释为 109，108，107，106，105，104，103，102copy/μL，每个反应管加入2μL模板制作标准曲线。
实时荧光定量PCR分析运行程序为：95℃、3 min；95℃、5s，60℃、20s，40个循环。
采用25μL反应体系，SYBR Mix（Takara Biotechnology，日本）12.5 μL，10μmol/L的上、下游引物各0.5μL，ddH2O 9.5 μL，模板2μL。所有操作均需在冰上进行，每个样品做3个平行，每次定量实验均需要同时做标准曲线。
在崇明东滩的A/B 2个样区分别设置3个取样点，研究发现A/B区土壤有机碳含量有明显差异。
由于A/B区有机碳输入相同，而土壤微生物呼吸强度与土壤有机碳含量呈负相关，在此条件下土壤微生物群落结构对土壤微生物呼吸强度影响较大［8］。因此首先对样品中的微生物群落结构进行了DGGE分析，结果见图1，从DGGE图谱可知A区与B区的微生物群落结构存在较大差异。
选择有代表性的23个条带（条带1-23）割胶克隆后测序，将测序结果在NCBI基因库比对，结果显示在23个测序条带中，有6个条带为变形菌，占测序菌种数的26.1%，有12个条带与Proteobacteria遗传相近或属于Proteobacteria，可判断Proteobacteria是该区土壤的优势菌。而α-，β-，γ-Proteobacteria在 A/B区均多次出现且有差异，可能在土壤微生物呼吸中起重要作用，进而与A/B区土壤有机质含量差异相关。
