金线莲抑制斑马鱼黑色素形成的活性组分筛选及机理研究
许璟瑾;张文娟;王静怡;姚丽云;潘裕添;欧一新;薛钰
【摘 要】为探索金线莲中对黑色素形成具有抑制效果的活性组分,本研究对金线莲进行分离、提取,获得总提组、醇沉组与醇提组,利用斑马鱼筛选金线莲具有美白作用的活性组分.将受精后0.75 h的斑马鱼胚胎分别暴露于不同浓度的金线莲总提组、醇沉组、醇提组,72h时观察结果表明,金线莲醇提物能有效抑制斑马鱼胚胎黑色素和黄色素沉着,浓度越高抑制效果越明显,且不影响胚胎生长发育.进一步采用半定量PCR和整胚原位杂交技术定量和定性地检测黑色素形成相关基因mRNA表达,结果表明金线莲醇提物可以有效降低silv、tyr和tyrp1a等黑色素合成相关基因的转录水平,且具有浓度依赖关系.通过检测酪氨酸酶活性显示,加入醇提物的实验组其酪氨酸酶活性随着处理浓度升高而逐渐降低.此外,在黑色素已经大量形成的情况下,金线莲醇提物仍可通过下调黑色素合成相关基因的mRNA表达及酪氨酸酶活性来抑制黑色素的形成,并且这种抑制效果可在金线莲醇提物撤除后得到恢复.上述实验结果表明,金线莲醇提物能显著抑制斑马鱼黑色素的形成,本文为金线莲在美白产品领域的开发和应用方面提供了有力支撑.%The aim of this study is to explore the active components
of Anoectochilus roxburghii capable of inhibiting melanin formation using chemical paration and extraction and functional analysis.Anoectochilus roxburghii were extracted with alcohol and parated into three groups:the total extraction group,alcohol extracted group and alcohol precipitated group.Zebrafish embryos at 0.75 h post-fertilization were expod to various concentrations of the three groups of extracts,and analyzed at 72 h,using mi-quantitative RT-PCR and in situ hybridization.The results showed that the alcohol extracts inhibit melanogenesis most significantly in the zebrafish embryos.The mRNAs of melanin-related genes,such as silv,tyr,tyrp1a,were down-regulated by the alcohol extracts spatially and temporally.The alcohol extracts also inhibited the activity of tyrosina,a key enzyme in melanogenesis,in a dosage dependent manner.In addition,the alcohol extracts also display a remarkable inhibitory effect on melanin synthesis through down-regulation of mRNAs of melanin-related genes and tyrosina activity in zebrafish embryos,in which a large amount of melanin has already been synthesized.Such inhibitory effect could be reverd after the withdrawal of the alcohol extracts.Our results showed that the alcohol extracts of Anoectochilus roxburg
hii can significantly inhibit zebrafish melanogenesis,supporting the notion that Anoectochilus roxburghii could potentially be ud in the development and production of natural whitening products.
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2017(039)012
【总页数】10页(P1178-1187)
【关键词】斑马鱼;金线莲醇提物;黑色素;基因表达;酪氨酸酶
【作 者】许璟瑾;张文娟;王静怡;姚丽云;潘裕添;欧一新;薛钰
【作者单位】闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;闽南师范大
学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;上海交通大学生命科学技术学院,上海200240;闽南师范大学,福建省菌类活性物质工程技术研究中心,漳州363000;膜生物学国家重点实验室,北京100101
【正文语种】中 文
金线莲(Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.)又名金线兰、花叶开唇兰，是兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)多年生珍稀药用植物[1]。金线莲的主要产地集中在福建和台湾，享有“药王”、“金草”等美称。在民间，金线莲对于肝炎、肾炎、肺炎、糖尿病、风湿病、小儿惊厥、毒蛇咬伤等病症有很好的治疗效果[2]。本研究在实验过程中发现，金线莲水提物能使斑马鱼胚胎黑色素合成减少，暗示其可能在黑色素形成过程中具有抑制作用。鉴于金线莲在美白功效方面的研究较少且作用方式尚不明确，本研究以斑马鱼(Danio rerio)为模型筛选金线莲具有美白效果的活性组分并进行初步的机理研究。
目前，对于美白活性物质的研究大多是以豚鼠(Cavia porcellus)皮肤或者小鼠(Mus musculus)黑色素瘤细胞作为模型，但这些模型存在耗时长、成本高、操作复杂等缺点[3]。斑马鱼与人类基因相似度高达87%，并且胚胎具有光学通透性，可以清楚地观察到体
内黑色素沉着，是研究黑色素化合物活性的优良模型[4~6]。
斑马鱼在发育初期全身透明，胚胎发育至24 h时黑色素开始从视网膜上皮生长[7]。色素细胞起源于背部外胚层分化的一群细胞—神经嵴细胞，然后增殖、迁徙、分化成色素母细胞[8]。整个黑色素的合成过程主要涉及小眼畸形转录因子(microphthalmia transcription factor, Mitfa)、酪氨酸酶(tyrosina, TYR)、多巴色素互变酶(dopachrome tautomera, Dct)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosina-related protein 1, Tyrp1)、银色毛发(premelanosome protein, Silv)和眼皮肤白化病Ⅱ型(oculocutaneous albinismⅡ, Oca2)等多个关键因子[9,10]。Mitfa调控酪氨酸基因家族的表达，其编码的碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链转录 因子对黑色素细胞的发育、分化具有核心的调控作 用[11~14]。tyr基因编码的TYR是黑色素形成过程中的主要限速酶，催化黑色素合成途径中两个起始步骤，即酪氨酸羟基化成3,4-二羟基苯丙氨酸(3,4-Dihydroxyphenyl L-Alanine,DOPA)和DOPA氧化成多巴醌(dopaquinone, DQ)。多巴醌经过多聚化反应生成无色多巴色素[15,16]，无色多巴色素极不稳定，迅速氧化成多巴色素。多巴色素既可以在多巴色素互变酶(Dct)作用下羟化为5,6二羟基吲哚酸(5,6-Dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)，也可以脱羧为5,6二羟基吲哚(5,6-Dihydroxyindole, DHI)。DHICA在酪氨酸酶相关蛋白1 (TYRP1)及TYR作用下生成5,6
吲哚羧酸，然后在银色毛发(Silv)作用下生成黑色素。而DHI则经由TYR催化氧化成5,6吲哚醌，最后生成黑色素。Oca2在黑色素常染色体的转运中具有重要作用[17]。
随着环境污染越来越严重，导致臭氧层遭到破坏，紫外线到达地面的量增多，使得体表黑色素过多地沉积。虽然黑色素能降低紫外线对皮肤的伤害[18]，但是过多的色素沉积不仅影响美观，而且会引起雀斑、黑斑病，严重影响人们的生活质量。目前市面上的许多化妆品由于添加化学成分及重金属，虽美白效果显著，但却存在潜在的不可逆的损伤风险，危害到人体健康。人们更青睐于健康的、对人体无害的纯天然植物活性成分。中草药因其药效温和、不良反应小而得到大家的一致认可，而金线莲是福建地区著名的药用植物，因此，本研究通过筛选对黑色素形成具有抑制作用的金线莲活性组分以及初步的机理研究，可为金线莲在开发新型、天然美白护肤产品方面提供实验思路和证据，具有重要的应用价值。
福建金线莲由闽南师范大学菌物产业工程技术中心提供。
斑马鱼为TU品系，28℃淡水中饲养，采用14 h光照/10 h黑暗的光照周期，水循环系统的pH值保持在6.9~7.5，每日喂3次丰年虾。
实验前一日，挑选发育正常，达到性成熟的斑马鱼放置于配鱼缸中，将雌雄鱼用隔板分开，于次日上午8:30抽离中间隔板，30 min后收集受精卵 于含有Holfreter水(0.05 g/L KCl、0.1 g/L CaCl2、 0.025 g/L NaHCO3、3.5 g/L NaCl)的培养皿中，28℃恒温培养。
1.2.1 金线莲组分的分离与提取
准确称量1 kg新鲜的金线莲全草，按料液比1:4加入蒸馏水，粉碎，80℃水浴搅拌提取。离心收集上清，沉淀物重复提取一次，把两次上清合并后用旋转蒸发仪蒸发浓缩至一定体积，一部分用真空冻干机冻干，获得组分一——金线莲总提物。另一部分加入4倍于浓缩体积的无水乙醇，于4℃冰箱沉淀过夜。醇溶物蒸发浓缩至一定体积用真空冻干机冻干，获得组分二——金线莲醇提物。醇沉物加入蒸馏水溶解，旋转蒸发仪蒸发浓缩至一定体积后用真空冻干机冻干，获得组分三——金线莲醇沉物。
1.2.2 金线莲在斑马鱼中具有抑制黑色素功效的活性组分筛选
药物浓度的确定：为了探索金线莲各组分(金线莲总提物、金线莲醇沉物、金线莲醇提物)对斑马鱼胚胎作用的最佳浓度，以6孔板为实验容器，每个组分设置5个浓度梯度，分别为
0 μg/mL (Holfreter水)、250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL、 1000 μg/mL(所有药剂均溶于Holfreter水)。每孔加入30枚胚胎，每12 h挑走死亡胚胎并做好记录，更换药物，放置于28℃恒温培养箱培养。待胚胎发育至72 h时统计胚胎死亡数同时观察发育状况。
胚胎暴露实验：收集受精后0.75 h的胚胎分到6孔板，每孔30枚。每个组分按照探究好的最佳浓度梯度加药，每12 h换药。Holfreter水设为空白对照组，总提物组分和醇沉物组分最佳浓度梯度均为100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL；醇提物组分最佳浓度梯度为100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL。因熊果苷(Arbutin，Ar)是氢醌的重要衍生物，具有安全性高、美白效果明显等特点，以200 μg/mL熊果苷溶液作为标准阳性对照[19]。待胚胎发育至72 h时，在体视显微镜下观察其体表黑色素沉着情况，拍照并记录分析。选择对黑色素形成抑制效果最佳的组分进行后续的实验。
1.2.3 黑色素合成基因的表达
1.2.3.1 引物设计
与黑色素相关的基因序列从bi. v/网站下载，引物通过软件Primer Premier 6.0设计。引物序列如表1所示。
1.2.3.2 半定量PCR检测黑色素合成基因的表达
将受精后0.75 h的胚胎加入不同浓度梯度的金线莲醇提物处理，以熊果苷为阳性对照，待胚胎发育至72 h，每个处理组各收集50枚，提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，具体操作方法参照文献[20]。之后采用降落(touch down)PCR扩增目的基因条带，扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 30 s，之后每个循环降低3℃，72℃ 30 s，共6个循环；然后再95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共27个循环；最后72℃延伸10 min，16℃保存1 h。
