收稿日期:2006-01-22
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大熊猫精浆蛋白的SDS2PAGE电泳研究
张明1,2，鲜红3，侯蓉23，朱庆1，郑鸿培1
(11四川农业大学动物科技学院繁殖生物技术实验室，四川雅安625014;21成都大熊猫繁育基地濒危野生动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室;31成都市妇产科医院生殖不孕研究所)
摘要：本试验采用SDS2PA GE对大熊猫精浆进行电泳并对电泳条带进行分析，探讨特异条带与大熊猫精液质量的关系。结果显示：大熊猫精浆SDS2PA GE电泳共分离得到12条蛋白谱带，其中6个条带为所有个体大熊猫精浆样品所共有，共有条带的相对量在不同个体之间不存在差异(P>0105)。试验中部分大熊猫精浆出现的特异蛋白带和共有带蛋白含量与精液质量无相关性。
关键词：大熊猫；精浆；电泳；精液质量；聚类分析
中图分类号:Q9591838;Q503 文献标识码:A 文章编号:1000-7083(2006)04-0735-04
Study on G iant Panda(Ail uropoda melanoleuca)Seminal Plasma Protein
Electrophored with SDS2PAGE
ZHAN G Ming1,2,XIAN Hong3,HOU Rong23,ZHU Qing1,ZHEN G Hong2pei1
(1.The Laboratory of Reproductive Biology and Technology,College of Animal Science&Technology, Sichuan Agricultural University,Y aan,Sichuan Province625014;2.The K ey Laboratory of Reproduction and Conrvation
G enetic of Endangered Wildlife of Sichuan Province,Chengdu Rearch Ba of G iant Panda Breeding;
3.The Department of Human Reproduction and Sterility,Maternity Hospital in Chengdu)
Abstract:In the study,giant panda minal plasma protein was parated by SDS2PA GE and their relationship with men characteristics was analyzed.The results are as follows:Twelve protein bands in giant panda minal plasma were identified by SDS2PA GE,and the molecular weights wer
e7419,5916,5612,5417,4713,3812,3018,2318, 1814,1618,1410and1314kDa res pectivelyr.Six of them(7419,5916,5612,4713,3018and1314kDa)were prent in all samples and relative quantity was no different among them.However,no relationship was found among the abnormal protein bands appeared in veral samples and men characteristics in our experiment.
K ey w ords:giant panda;minal plasma;SDS2PA GE;men quality;clustering analysis
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精液由精子和精浆组成，精浆是由睾丸液、附睾液和几种副性腺分泌物混合而成。精浆内含有蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素、激素及微量元素等物质，是射精后精子生存的环境，同时也是输送精子的必需介质，对调节精子的成熟以及为精子提供能量和营养物质具有重要作用。精浆中的蛋白成分主要来自前列腺、附睾、精囊腺等性腺分泌的混合物。蛋白质中的获能因子能够影响精子的成熟和生存，因此精浆蛋白对生殖功能有重要影响。测定精浆蛋白可以评价副性腺的病变，同时精浆蛋白的量和组成在一定程度上也反映了机体的免疫功能。某些蛋白含量的高或低，直接影响精子的成熟，干扰精子的获能，从而对精液质量产生影响，如精浆中的转铁蛋白、精子运动相关蛋白等[1]，它们能从不同的方面影响精子的数量和质量。对于精浆蛋白曾经作过广泛地研究，特别在啮齿类动物、猪、马和牛方面。
对于精浆中蛋白电泳谱带分析的方法主要有醋酸纤维膜、琼脂糖、SDS2PA GE和高效毛细管电泳法。张杰等采用不连续SDS2PA GE分析精浆蛋白带谱变化，用以判断人梗阻性无精症，结果证实不连续SDS2PA GE对样品有高度的浓缩效应，可明显提高电泳分离的分辨率和蛋白带谱的清晰度[2]。而SDS2PA GE平板电泳可以在同一张凝胶上直接比较分析精浆蛋白组分的改变，而且具有分辨率高，带谱丰富和结果准确可靠等优点[3]。高效毛细管电泳技术是近年发展起来的一种新型分离技术，尤其对蛋白质和核酸的分析技术日趋成熟。本试验首次对大熊猫精浆进行不连续SDS2PA GE电泳分析，并初步探讨大熊猫精浆蛋白和精液质量的关系。
1 材料与方法
111 大熊猫精液的采集与精浆的制备
受试大熊猫均来自成都大熊猫繁育研究基地，在繁殖季节2～5月，通过麻醉后直肠电刺激采精采集大熊猫精液。5个个体共采精19次。将采得的精液部分用Ham’s F210稀释后作常规精液品质分析，分析方法见参考文献[4]，其余离心分离精浆，所得精浆250g离心10min，取上清液分装后置-20℃保存备用。
112 精浆蛋白SDS2PAGE电泳
SDS2PA GE用10%的分离胶和40%的浓缩胶。精浆样本解冻后各取15μl加入上样缓冲液后100℃保持3min使蛋白质变性，标准蛋白采用同样方法处理，冷却后取10μl点样；在平板垂直电泳仪上于120V、40mA条件下平衡30min左右，待样品进入分离胶后，以225V、70mA电泳4～6 h；用考马斯亮蓝R2250染色4h,10%乙酸脱色；对染色的凝胶用Bio2Rad G el Doc进行拍照，用Bio2Rad开发的软件Quantity One Ver4131进行条带比对、相对量分析。
113 统计分析
精浆蛋白电泳结果进行了t检验，对精浆中相同蛋白条带含量的差异进行F检验。
2 结果分析
211 精浆蛋白电泳条带和分子量分析
用Bio2Rad软件Quantity One Ver4131取4%容差对精浆蛋白SDS2PA GE电泳图谱(图1A)进行条带自动配对，得到电泳模式图(图1B)。从图1可以看出，在大熊猫精浆样品的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，共分离出了12条蛋白谱带，其中1、2、3、5、7、12条带为所有个体大熊猫精浆样品所共有，其余条带在不同个体大熊猫中有缺失，而且同一个体在不同次采精之间也存在条带差异。利用已知分子质量的标准蛋白Marker的相对迁移率计算出各蛋白谱带的相对分子质量，结果见表1。
分离出的12条蛋白条带，分子量最小的蛋白相对分子质量为1315±0127kDa，最大的为7418±0127kDa。
212 精浆蛋白谱带特性与精液质量的相关分析根据电泳结果，通过t检验，本实验中部分大熊猫个体出现的特异蛋白4、6、8、9、10、11条带与精子密度、活力、运动状态及精子形态完整率上均不存在显著差异(P>0105)。
213 精浆蛋白含量与精液质量的相关分析
用BioRad软件Quantity One Ver4131软件对16个泳道所有条带的相对量(relative quantity)进行分析，所得结果见表2。5个个体共有蛋白的相对量之间差异不显著(P>0105)，表明这些蛋白可能是精浆的必需蛋白。将1、2、3、5、7和12条带的含量与精液质量指标进行相关分析，并对相
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关系数进行t 检验，均未达到显著水平(P >0105)。
表1 大熊猫精浆蛋白的相对分子量(kD)
T able 1 Molecular w eights (kD)of giant pand a minal plasm a protein
谱带号
Band No 1
大熊猫个体编号及蛋白相对分子量
G iant panda individual number and molecular weight
1号2号3号4号5号Mean ±SD
1741974197419741974137418±01272591659165916591659105915±01273561256125612561255185611±0118
4-541754175417--5471347134713471347104712±0113
6--3812-3715-7301830183018301830123017±0127
8--2318---91814-----1016181618--1615-11--1410---12
1314
1314
1318
1318
1312
1315±0127
图1 大熊猫精浆蛋白SDS 2PA GE 电泳的考马斯亮兰染色A 和模式图B
Fig 11 Coomassie blue stainning protein A of giant panda minal plasma by SDS 2PA GE and diagrammatic model B
表2 不同个体精浆蛋白条带相对含量
T able 2 R elative qu antity of protein in different individu al minal plasm a
谱带号Band No 1
大熊猫个体编号及蛋白相对含量
G iant panda individual number and relative quantity of protein
1号2号3号4号5号1517±0181961427±0120751628±018686130±01445613282111981±01720141319±01828121927±01494141514±01991131217321272±01518
31354±1125121184±0112431233±01605310784-414295±0116231452±0125441353±11912-551169±01923
41515±01754
41656±0169661641±11348
518376--21364±01280-21517781635±11405
111396±31597
81853±0173661079±21251
913418--81698±01831
--951400±11901----1061003±21918
21972±01661
--2130811--91606±11427--12
71443±01872
101288±01788
71912±11389
9142±21526
81368
7
37
3 讨论
精浆主要由副性腺分泌物组成，精浆内存在酶、激素、各种细胞因子、抑制素以及各种免疫球蛋白等。从精浆蛋白组成及物种和个体间蛋白组分的相对差异[5]，到精浆蛋白的存在与否与精液质量的相关性研究[6～8]，人们都作了较为广泛地研究，并得到了一些有益的结果，如Jobim发现，马精浆蛋白的15～16kDa蛋白和13～14kDa蛋白与较高的精液质量相关[8]，而25～26kDa蛋白的出现则与较低精液质量有关。马精浆中两种蛋白的缺失与冷冻解冻后精子活力有关[7]。本试验首次采用SDS2PA GE方法分离大熊猫精浆蛋白，在10%分离胶条件下共分离得到12条蛋白谱带，其分子量分别为7419kDa、5916kDa、5612kDa、5417 kDa、4713kDa、3812kDa、3018kDa、2318kDa、1814kDa、1618kDa、1410kDa和1314kDa，其中1、2、3、5、7、12号谱带为所有个体大熊猫精浆样品所共有，其余谱带在不同个体大熊猫中则分别有缺失。从电泳图谱可以看出,1号和4号大熊猫各精
浆样品的电泳谱带基本一致，但2号和3号大熊猫的不同样品之间精浆蛋白存在一定的差异，同时各条带蛋白浓度也有所不同。该试验结果与其它动物(牛、马等)精浆蛋白谱带特性存在一定差异，这可能与动物种类的差别及研究者采集、保存和分析样品的条件不同有关。在对各蛋白谱带的缺失与否、蛋白质含量与大熊猫精液品质的关系进行分析时，没有发现二者之间相关性的存在。
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