LYST蛋白表达量在Chediak-Higashi综合征临床诊断中的应用

更新时间:2023-05-05 22:15:46 阅读: 评论:0

LYST蛋白表达量在Chediak-Higashi综合征临床诊断中的应用
杨业然;陈峰;石金;郭永丽;张杰;倪鑫;徐子刚;刘原虎;唐力行;金雅琼;杨扬;王森分;顾洋;赵靖;陈敏
【摘 要】目的 探讨LYST基因突变导致的蛋白差异表达在罕见病Chediak-Higashi综合征(Chediak-Higashi syndrome,CHS)中的临床诊断应用价值.方法 利用免疫印迹(Western blotting,WB)检测CHS患儿、患儿直系家属以及健康志愿者的外周血白细胞中LYST蛋白表达量.结果 患儿白细胞中LYST蛋白出现两种截短体(p.R1104X、p.N2535KfsX2),呈高表达,而患儿直系家属以及健康志愿者白细胞中未检测到LYST蛋白表达.结论 CHS患儿外周血白细胞LYST截短体表达量较健康人显著增加.因此,免疫印迹检测LYST截短体的高表达可以作为辅助临床诊断CHS的一种新方法.%Objective To investigate the clinical application of amino acid induced LYST differential expression in Chediak-Higashi Syndrome (CHS) diagnosis.Methods Western blotting was performed to detect the expression levels of wild-type LYST or truncations in peripheral blood white blood cells (WBC) of two CHS patients, their healthy lineal relatives and two unaffected healthy volunteers.Results Higher expressi
on levels of two LYST truncations (p.R1104X, p.N2535KfsX2) were obrved in WBC protein lysis of patients.However, there was no LYST signal in the five healthy samples.Conclusion The prent study revealed that truncated LYST proteins are highly expresd in peripheral blood WBC of two CHS patients, while no LYST expression was found in healthy controls.Our study prents a new accessory diagnosis approach of CHS dia by detecting highly expresd LYST truncations.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2017(024)008
【总页数】5页(P841-844,874)
【关键词】Chediak-Higashi综合征;LYST;Westernblotting;临床诊断
【作 者】杨业然;陈峰;石金;郭永丽;张杰;倪鑫;徐子刚;刘原虎;唐力行;金雅琼;杨扬;王森分;顾洋;赵靖;陈敏
【作者单位】首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室, 儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院儿童临床数据 和样本资源库,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室, 儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室, 儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室, 儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院儿童临床数据 和样本资源库,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室, 儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院儿童临床数据 和样本资源库,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,
北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室, 儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院儿童临床数据 和样本资源库,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科,北京 100045;深圳市儿童医院皮肤科,广东 深圳 518038;首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045;首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科,北京 100045
【正文语种】中 文
Chediak-Higashi综 合 征 (Chediak-Higashi syndrome,CHS)是一种罕见的常染色体隐性疾病。该病临床症状主要表现为局部的眼皮肤白化病、易反复感染、少量的出血倾向或迟发的进行性神经功能缺损[1]。CHS患者的平均发病年龄是5.8岁,其中绝大部分患儿于10岁前因感染、出血死亡[2];而成人患者病程缓慢,可表现出进行性神经功能退变[3],故而对CHS患儿尽早确诊可为临床治疗争取更大主动性,具有极为重要的临床
意义。临床诊断CHS除依据患者的上述临床症状外,可靠的诊断标准是实验室显微镜下见外周血涂片中性粒细胞及其前体细胞内存在异常粗大的溶酶体颗粒[4-5]。近年来随着研究不断深入,人们发现溶酶体转运调节因子 LYST(lysosomal trafficking regulator gene,又称Chediak-Higashi syndromel,CHS1)基因突变是导致CHS的重要原因,且未见LYST基因在其它疾病中存在致病突变的相关报道,因此LYST基因测序已经成为CHS临床诊断重要依据。一方面显微镜检验血涂片方法存在一定主观性,对检验人员经验要求高;另一方面,LYST基因检测耗时长、成本高,所以临床急需新型有效的经济型检测方法对CHS快速诊断。本课题组前期发现一种LYST复合杂合突变c.3310C>T, p.R1104X; c.7785_7786insT,p.N2535KfsX2[6]。分析显示该突变可导致LYST蛋白形成两种不同大小的截短体,提示我们可直接检验患者外周血白细胞中LYST蛋白表达,作为临床确诊CHS的一个新诊断方法。
本研究共纳入血液样本7例。其中2例为首都医科大学附属北京儿童医院确诊收治的CHS患儿(1#、2#),3例取样自 CHS患儿直系家属(姐姐、母亲、父亲;3#、4#、5#),其余 2例为与患儿及其家属无血缘关系的健康志愿者(6#、7#)。本研究符合伦理要求,患者及其家属均签署了知情同意书。
RIPA细胞裂解液(50 mmol Tris-HCl pH7.4、0.5%NP-40、0.25%脱氧胆酸钠、150 mmol NaCl、1 mmol EDTA,用前加入 1 mmol PMSF、1 mmol Na3 VO4和1×cocktail)、LYST抗体(sc-136746)购于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司。GAPDH抗体(5174S)购于Cell Signaling公司。罗丹明标记驴抗羊IgG(926-32214)、罗丹明标记羊抗兔IgG(926-32211)购于中杉金桥。蛋白分子 marker(26634)购于Thermo Fisher公司。金属浴购于Thermo公司。Western blotting电泳槽、转膜槽购于Bio Rad公司。Odysy红外荧光成像系统购自LI-COR公司。
3.1 样品制备
静脉取外周血2mL置于血液提取管中,向血液提取管中加入2mL红细胞裂解液,样本离心(3000rpm,3min),吸出血浆,将剩余样本全部吸至新的提取管中。加入红细胞裂解液,终体积10 mL,用吸管反复吹打使其与样本充分混合,室温放置3 min;常温离心(3000 rpm,3 min),弃上层液体。加生理盐水至终体积10 mL,吸管吹打底层细胞,洗涤裂解液,常温离心(3000 rpm,3 min),弃上层液体。向提取管中加入生理盐水,用吸管吹打,使其与底层细胞混合,转移至2mL冻存管中,常温离心(3000 rpm,5 s),弃
上层生理盐水。加入200μL RIPA蛋白裂解液,冰上放置40 min,4℃离心(13000 rpm,15 min),取上清至新的离心管中,-80℃保存。蛋白质裂解液分别加入5×SDS蛋白上样缓冲液并于95℃金属浴中加热10 min,12000 rpm离心1 min,混合均匀后上样。
3.2 免疫印迹
配置6%的SDS-PAGE胶,每种样品上样60μL用于检验目的蛋白LYST。同时配置15%的SDSPAGE胶,每种样品上样20μL用于检验内参蛋白GAPDH。电泳后转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉室温封闭1小时,一抗4℃过夜,二抗室温孵育1小时,Odysy红外荧光成像系统扫膜。LYST一抗的稀释比例为1∶250。二抗兔抗山羊的稀释比例是1∶3000。GAPDH一抗稀释比例是为1∶500。二抗山羊抗小鼠的稀释比例为1∶5000。
我们采集了7名受试者外周血,提取白细胞总蛋白,采用WB方法检测蛋白裂解液中 LYST和GAPDH蛋白的表达。结果发现,两名 CHS患儿(1#、2#)外周血白细胞样本中可以检测到两种高表达的LYST蛋白截短体,而患儿的三名直系家属(姐姐3#、母亲4#、父亲5#)和两名与患儿无血缘关系健康志愿者(6#、7#)的外周血白细胞蛋白样本中均未检测到LYST蛋白或其截短体的表达。结果说明,LYST蛋白在CHS患儿外周血白细胞中表达量
较健康人显著增高,并且形成两种截短体,是潜在的临床检测CHS的诊断标识。见图1。
CHS作为一种罕见病,目前全球范围内已报道的病例不超过500例。CHS临床表现主要为眼皮肤白化、易反复感染、少量的出血倾向或迟发的进行性神经功能缺损[1]。CHS常须与以下疾病甄别:眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism,OCA)、格里瑟里综合征(griscelli syndrome,GS)、赫日曼斯基综合征(hermanskypudlak syndrome,HPS)等。OCA表现为皮肤、头发和眼睛部位的黑色素生物合成完全或部分丧失[7-8];GS主要临床表现也是身体局部出现皮肤白化[9-11];而HPS患者除了出现白化病变外,还存在出血倾向和进行性免疫缺陷[12];这些症状都与CHS十分相似。因此,单纯根据临床症状来甄别这些疾病存在极大误诊率。随着研究的不断深入,分子水平的基因诊断为临床诊断提供了有力证据。基因测序检测LYST基因的致病突变是目前临床上公认的确诊CHS的重要依据,但依旧存在成本高、耗时长、结果解读困难等瓶颈。
本研究中的两例患儿为兄妹,因头发、皮肤、四肢呈现白化症状来我院皮肤科就诊。除白化症状外,两名患儿均出现了反复的上呼吸道感染,未见高危出血倾向、神经退行性改变和免疫缺陷,临床上依据典型症状最早诊断为GS。后经全基因组测序发现CHS相关致病基
因LYST存在复合杂合突变,而GS相关致病基因MYO5A、RAB27A或MLPH均为野生型,故最终确诊患儿为CHS。

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