诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响
摘 要: 观察诱导剂对工程菌发酵及重组目的蛋白表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。本文主要阐述了几种诱导剂对工程菌发酵菌体密度以及重组目的蛋白表达量的影响,分析了不同诱导剂诱导表达重组蛋白的特点及存在的问题。同时着重介绍了阿拉伯糖做为诱导剂对重组目的蛋白表达量的影响,研究得到工程菌发酵的最优条件,为阿拉伯糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。
关键词: IPTG ; 乳糖;阿拉伯糖;诱导;发酵
近年来,重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术。采用高密度发酵技术,提高菌体的发酵技术,提高菌体的发酵密度,最终提高产物的比生产率,不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取,还可以缩短生产周期、降低生产成本,从而极大地提高在市场上的竞争力。然而在研究高效发酵过程中,人们往往会遇到表达效率难以得到最大限度的提高与产率较低等问题。在众多影响因素中,诱导剂对于外源基因高效、稳定的表达起着非常重要的作用。由于Lac 启动子是使用最早、研究最详细的启动子之一,所以目前用于诱导重组蛋白表达的诱导剂主要是IPTG和乳糖,而对阿拉伯糖诱导重组蛋白表达的研究
尚少。但有文献报道,Lac 启动子的控制很不严密,在无诱导剂IPTG的情况下可有较高的表达。而阿拉伯糖(Ara)启动子是一个控制较严密且具较高表达水平的启动子将得到普遍应用。
1、操纵子类型及调控类型
原核生物基因表达调控主要发生在转录水平上,转录调控的基本单元是操纵子。
1.1 操纵子的概念
根据操纵子学说,很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列,由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。
1.2乳糖操纵子——可诱导负调控
乳糖操纵子的结构:由启动子(P)、操纵基因(O)、调节基因、结构基因所组成。操纵基因I编码一个可扩散的分子,引起基因的阻遏。以后这种分子被证明为蛋白质,现在称之为阻遏蛋白。阻遏作用并不是绝对的,即使在阻遏情况下,每个细胞也有少数拷贝的β半乳糖苷
酶及半乳糖苷透过酶。当供给细胞以乳糖时,lac操纵子即被诱导,一个诱导物分子结合在阻遏蛋白的特异部位上,引起阻遏蛋白构象的改变,结果使阻遏蛋白从操纵基因上解离下来。在此系统中的诱导物并非乳糖本身,而是乳糖的同素异形体,称为异乳糖。乳糖进入E.coli细胞,被转化成异乳糖。异乳糖与阻遏蛋白结合后,它们即从操纵基因上解离下来,lac操纵子基因即开始表达,β半乳糖苷酶的浓度可以增加1000倍之多。
1.3 阿拉伯糖操纵子——可诱导正调控
细菌中有一个阿拉伯糖操纵子,在葡萄糖馈乏时,它能利用阿拉伯糖作为能源。阿拉伯糖手机英语学习软件C基因编码一种C蛋白,除此之外翻译它能激活阿拉伯糖BAD操纵子的转录,操纵子由araB,araA及araD基因组成。C蛋白必须与阿拉伯糖形成复合物,才能完成调控,因此只有当底物存在时,酶才能生成。与乳糖操纵子相似,阿拉伯糖操纵子对葡萄糖很敏感,因此除阿拉伯糖及C蛋白外,它也被AMP及CAP控制。两种激活剂,C蛋白及CAP如何调节一个操纵子呢? 这个机理比较复杂,但是可以理解。C蛋白既是激活剂又是阻遏物,而且它以两种不同方式作为阻遏物。C蛋白在阿拉伯糖操纵子中的3个不同部位上结合,控制araI,araO1及araO1区。
2 几种诱导剂诱导重组目的蛋白表达的研究
2.1 IPTG
IPTG 是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂。然而由于IPTG 对于人体具有潜在的毒性,当利用IPTG诱导表达应用于人体的重组药物时,有可能对最终的产品带来一些不利影响。另一方面,IPTG的价格也较为昂贵,尤其是在较大体积的发酵罐中进行诱导时, IPTG 的应用会造成发酵成本的增加。
2.2 乳糖
乳糖是一种二糖,没有毒性,另外,由于其低廉的价格,使其有可能成为替代IPTG 的诱导剂。乳糖本身作为一种碳源,可以被菌体所代谢利用,同时,作为一种糖类物质,它的存在亦会导致菌体的生理及生长特性发生变化。与IPTG 所不同的是,乳糖自身无法进入到菌体细胞的内部,它需要借助于乳糖透过酶的作用,乳糖的转运因此受多种因素的影响。另外,乳糖进入细胞后仍然不能诱导Lac 启动子的启动。它需要经过β- 半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖才会起到诱导剂的作用。与IPTG相比,利用乳糖作为诱导剂其诱导过程更为复杂和麻烦,而且诱导效果也有所不及。
2.3 温度
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体,30度下抑制转录,42度开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物,成本低,但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果,而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活,一些蛋白酶会影响产物稳定。
并且有文献报道,Lac 启动子的控制很不严密,在无诱导剂IPTG的情况下可有较高的表达,同时发现携带Lac 启动子驱动抗体基因的载体在扩增后明显减少。进一步观察了此现象对噬菌体抗体库多样性的影响,发现随着抗体库的扩增,使用Lac 启动子的抗体库中含有抗体基因的克隆的比例迅速减少。
2.4 阿拉伯糖
阿拉伯糖启动子调控系统线性度很好,在0∼0.02 g/L 范围内能够通过阿拉伯糖的浓度来合理控制表达量大小. 与此相比,T7 和lac 等表达系统泄漏表达严重,且加入诱导剂即完全开放表达,可控度较差,这显示了阿拉伯糖启动子调控系统的一大优势. 基于阿拉伯糖启动子构建的表达系统控制严紧,可调控性强,对于蛋白表达的精细调控具有很好的启示。而且使用Ara 启动子的抗体库中,含有抗体基因的克隆的比例基本无变化,提示用Ara 启动子构建噬菌体抗体库优于Lac 启动子,可更好地保证抗体库的多样性。由此可见,阿拉伯糖作为诱
导剂的研究对于重组基因工程药物的工业化生产具有十分重要的意义。然而,国内利用乳糖诱导重组蛋白表达的还很少,而且因为表达产物的不同,实验条件也有不同。
3 影响阿拉伯糖诱导重组目的蛋白表达的因素
3.1 诱导时间对重组蛋白表达的影响
菌体呈典型的S 型生长, 2 h 后进入对数生长期, 7 h 后生物量达到最高点。蛋白的表达在诱导后6 h 达到最高, 之后明显下降, 致使蛋白合成量下降。因此诱导后6 h 时, 是菌体量和蛋白表达量均较高的时间。
3.2 诱导开始时间对重组蛋白表达的影响
如较早开始诱导, 菌体合成蛋白的时间也提前, 而蛋白的产生会影响菌体的生长。结果表明,在菌体对数生长期开始诱导会得到较高的生物量。
对于重组融合蛋白的合成, 诱导开始时间也会带来不同的结果。0 h 诱导, 达到最大合成量的时间提前; 4 h 时诱导,达到最大合成量的时间最晚。0、1、2 h 诱导的重组蛋白表达率
相近, 3 h 诱导合成的蛋白产量最大, 其次为2 h; 而0 h 诱导由于其生物量低, 因而最终的蛋白合成量低。对于重组蛋白来说, 在菌体生长的前期诱导为好。因此步步高点读机下载, 培养3 h 母亲节快乐英语时诱导为最佳诱导开始时间。
3.3 L-阿拉伯糖浓度对重组蛋白表达的影响
与不添加L-阿拉伯糖的对照组相比,以L-googletranslate阿拉伯糖终浓度为0. 002‰进行诱导, 3 h后重组蛋白的表达量仍然不显著contrail; 以L-阿拉伯糖终浓度为0. 02‰的剂量诱导2 h,重组蛋白表达量明显,3 h后含量继续增加; 0. 2‰的剂量诱导的重组蛋白表达量有类似变化. 因此,从经济角度考虑,选择L-阿拉伯糖终浓度为0. 02‰作为最佳诱导剂量joe什么意思.
3.4 培养温度对重组蛋白表达的影响
结果显示, 培养温度对蛋白的表达有一定的影响, 37℃时工程菌生长较好crushing, lycopene适合大肠杆菌蛋白表达系统的运转使得重组蛋白表达量较高,但由于蛋白表达速度过快,其表达产物大多以不可溶的包涵体形式存在,反而造成可溶性重组蛋白表达量降低, 因此,在加诱导剂后,选择30℃培养。
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基于阿拉伯糖诱导重组蛋白表达高效、准确、严密等种种优势,阿拉伯糖将逐步代替IPTG和乳糖成为诱导重组蛋白表达的诱导剂得到普遍应用。而对阿拉伯糖诱导工程菌表达重组蛋白发酵条件的优化更是重中之重。
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