不同菌源作用下煤微生物产甲烷的对比研究
罗永涛;邰超;武俐;佘加平;郝春生;赵同谦;齐永安
【摘 要】以矿井水为本源菌,以沼液、活性污泥和底泥为外源菌.从微生物群落构成和产气特征两个方面,分析4种菌源作用下5种煤样的微生物气化过程和产甲烷的差异性.结果表明:4种菌源的微生物主要由细菌和古菌构成,细菌占85％以上,古菌占整个菌群的5.8％～9.5％.本源菌和外源菌的微生物群落构成有共性,也存在一定差异,主要体现在细菌的芽孢杆菌科和古菌的广古菌门,本源菌中几乎未检出芽孢杆菌科,而3种外源菌中均有检出,所占比例随成气时间增加而增加.本源菌中广古菌门的初始比例高于3种外源菌;4种菌源的优势菌群均为Methanomassiliicoccaceae科.本源菌和外源菌作用下煤产甲烷过程分为三个阶段,表明本源菌和外源菌具有相似的成气特征.不同菌源作用下煤产甲烷的效率不同.与外源菌相比,本源菌作用下不同煤样的甲烷产生效率无明显优势.成气过程中,本源菌产氢气体积分数比3种外源菌低一个数量级,氢气生成量很少,说明本源菌中的产氢微生物群落较少,证明二氧化碳的氢还原过程并不主导第二阶段甲烷的生成.
【期刊名称】《煤炭转化》gtk
【年(卷),期】2018(041)006
【总页数】10页(P48-57)
【关键词】生物成气;本源菌;外源菌;甲烷;菌群结构whichever
【作 者】罗永涛;邰超;武俐;佘加平;郝春生;赵同谦;齐永安
【作者单位】河南理工大学资源环境学院,454000 河南焦作;河南理工大学资源环境学院,煤炭安全生产河南省协同创新中心,454000 河南焦作;河南理工大学资源环境学院,454000 河南焦作;河南理工大学资源环境学院,454000 河南焦作;山西蓝焰煤层气集团有限责任公司,晋煤集团煤与煤层气共采国家重点实验室,048000 山西晋城;河南理工大学,454000 河南焦作;河南理工大学资源环境学院,煤炭安全生产河南省协同创新中心,454000 河南焦作
【正文语种】中 文
【中图分类】hodoQ939;TQ54
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超级保龄球0 引 言
我国能源结构中煤炭比重占60%以上，且在21世纪前30年，煤炭在我国一次能源结构中仍将占主导地位[1].煤直接燃烧会带来诸多环境问题，寻求煤炭清洁高效利用的方法已成为国内外研究的热点[2-3].煤生物气化起源于次生生物气的相关研究成果[4]，是煤炭综合加工利用的一种新尝试[5].在煤微生物成气中，煤炭被细菌降解为结构简单的有机物、CO2、H2、甲酸和乙酸等，古菌中产甲烷菌群利用产甲烷底物生成甲烷[6-7].煤炭在微生物群落(细菌和古菌)协同作用下转化成甲烷[8-9]，可为煤炭清洁高效利用提供一种新思路与方法[10-11].
asktocall煤的生物气化生成率较低[12]，多为几百微摩尔每克[13]，按碳计算的转化率不足1%.目前，许多学者通过优化实验条件[14-19]和对煤进行预处理[20-21]来提高煤生物成气效率.在选择外源菌和本源菌上尚存在争议[22]，主要体现在产甲烷效率和菌群结构上的差异.煤生物气化过程需要多种微生物协同作用，最终产生甲烷[23-24].但也有报道表明，大分子煤本身的甲氧基侧链也可通过特定微生物作用直接产生甲烷[25]，因此对微生物菌源的研究仍需深入.
本实验在实验室模拟条件下，以矿井水为本源菌，以活性污泥、沼液和底泥为外源菌进行
富集培养.在60 d内，研究了采自郑州煤矿、平顶山煤矿、大同煤矿、义马煤矿和长治煤矿的5种煤样在4种菌源作用下产甲烷情况.分析了不同微生物群落对煤生物气化的影响.探讨了甲烷产生的可能途径，为后续生物气化模拟实验研究提供理论参考和数据支撑.
1 实验部分
1.1 煤样与菌源
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煤样分别为郑州超华矿煤(ZZ)、平顶山朝川矿煤(PDS)、大同王卞庄矿煤(DT)、义马耿村矿煤(YM)和长治常村矿煤(CZ)，经破碎筛分后，取粒径为80 μm～96 μm的煤样，高压蒸汽灭菌，干燥后备用.煤样的工业分析和元素分析见表1.一般来讲，煤变质程度越高，挥发分越低.由表1可以看出，PDS，ZZ和CZ的挥发分质量分数为10%～37%，PDS和ZZ属于气煤，CZ属于贫煤；煤样YM和DT的挥发分质量分数高于37%，属于褐煤；5种煤样煤阶依次为：ZZ>CZ>PDS>YM≈DT.
表1 煤样的工业分析和元素分析结果Table 1 Proximate and ultimate analysis of samplesSampleProximate analysis(ad) w/%MAVFCUltimate analysis(daf) w/%CHO*NSZ
Z1.1017.1616.7368.9888.294.175.441.560.54PDS1.2214.0324.6864.7586.504.595.691.511.71DT1.8614.7638.6652.2881.655.2111.261.390.49YM6.7111.3042.7750.7774.854.6319.420.950.15CZ1.1032.6717.8755.3085.884.238.221.470.20* By difference.
4种菌源分别取自山西蓝焰煤层气井矿井水(MW)，河南焦作某排污河流底泥(BM)，郑州王新庄污水处理厂厌氧活性污泥(AS)和实验室自制沼液(BS)[3,26].其中MW为本源菌，BM，AS和BS为外源菌，菌源的富集培养方法与文献[26，27]所述相同.
1.2 营养液成分
实验所用营养液成分为：1 L超纯水中加入1.0 g的NaH2PO4，3.0 g的K2HPO4，4.0 g的NH4Cl，2 g的Na2CO3，0.2 g的苯甲酸，4.0 g的酵母提取物，0.1 g的FeSO4.
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1.3 实验方法
1.3.1 微生物群落变化与微生物测序
immediately是什么意思采用文献[25]中的实验装置，在2 L三角瓶中加入1.6 L营养液和50 g YM煤粉.在持续曝氮气的条件下，分别加入4种菌源各200 mL，蜡封后置于37 ℃恒温培养.菌源MW在0 d，6 d，
28 d和60 d的微生物群落变化情况分别用MW-1，MW-2，MW-3和MW-4表示，依此类推.不同时间点取样50 mL，过滤后充分洗涤，滤液用微孔滤膜(0.45 μm/50 mm)过滤，将微生物转移至滤膜上；滤膜置于灭菌离心管中，在-5 ℃的冰箱中保存.
16S V4区引物(515F和806R)鉴定细菌多样性.扩增区域包括16S V3-V4/16S V4-V5和古菌16S V4-V5.采用Illumina Hiq 2500或Miq测序平台，利用双末端测序Paire-end(PE)的方法，每条序列从5’端和3’端各产生250 bp(Hiq 2500)或300 bp(Miq)的reads.分析前对原始数据进行过滤，滤除低质量的reads，获得有效数据Clean reads；通过PE reads之间的重叠关系将reads拼接成Tags， 进一步过滤获取目标片段(Clean tags)；在给定的相似度下将Tags聚类成OTU(operational taxonomic units)，然后进行OTU物种注释，得到每个样品的群落组成信息.DNA提取、PCR扩增和测序均由安徽华瑞基因生物科技有限公司完成.
1.3.2 煤生物气化效率模拟实验
煤生物成气模拟实验装置见图1.取样时，开启瓶盖上按钮，气密针从取样口中迅速取50 μL顶空气体后，关闭按钮，用气相色谱进行气体成分分析.其中，螺旋密封盖购于日本阿斯旺股份有限公司，防爆玻璃瓶购于美国赛默飞世尔科技有限公司.
图1 煤生物成气实验装置Fig.1 Coal biological gasification experimental devices 1—Sampling port；2—Open button；3—Clo button；4—Screw cover；5—Bottle；6—Medium；7—Coal；8—Water bath；9—Airtight needle
女孩英语名字大全在250 mL玻璃瓶中，分别加入100 mL营养液和5种煤样各5 g，控制组(KZ)不加煤样，曝氮气10 min后迅速封塞，在厌氧培养箱中分别接种4种菌源各25 mL，37 ℃恒温培养，每个样品设3个平行样.
实验结束后用导管将顶空气体排出，采用排水集气法测瓶中产生气的总体积(mL)，根据不同气体和总体积采用理想气体状态方程估算各种气体的总产生量(μmol)，并计算单位质量煤产气效率(μmol/g).
1.3.3 气体成分测定
仪器选用美国安捷伦6890气相色谱仪，配Carbonplot色谱柱(30 m×320 μm×3.0 μm)和TCD检测器，气密针进样，进样量50 μL. 色谱进样口温度200 ℃，柱箱温度25 ℃，检测器温度245 ℃，前检测器尾吹气流量10.0 mL/min.
2 结果与讨论
2.1 菌源群落结构组分
4种菌源的OTU结果显示微生物主要由细菌和古菌构成.其中细菌占85%以上，而古菌只占整个菌群的5.8%～9.5%，煤由微生物作用生成甲烷的过程是通过煤大分子分解成小分子物质再到成气实现的，其中小分子物质生成甲烷是在产甲烷菌属作用下完成的[28].而产甲烷菌属于古菌域，从古菌和细菌的数量来看，细菌明显多于古菌，初步说明了产甲烷步骤可能只是产甲烷生物链上的最后一个环节，而非速控步骤.之前的研究表明产甲烷并不是速控步骤，煤的降解才是速控步骤[29].
通过微生物测序，在门的水平上检出：拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、互养菌门(Synergistetes)、螺旋菌门(Spirochaetae)、软壁菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和WWE1共8个门.其中变形菌门可分泌酶和螯合剂等物质，这些物质可使煤达到降解的目的.图2所示为细菌门与细菌科的相对丰度分布.由图2a可知，在门的水平上，本源菌与3种外源菌的微生物群落构成差异不大，但存在一定的规律性.在4种菌源中Bacteroidetes和Firmicutes均为优势菌群，Synergistetes次之且
呈现出先增后降的趋势.由图2b可知，从科水平上，4种菌源的差异性表现在3种外源菌均检出芽孢杆菌科(Bacillaceae)，该科在菌群中所占比例随成气时间增加而升高，而在本源菌中几乎未检出.4种菌源的规律性表现在紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)为优势菌群，该科在菌群中所占比例随成气时间增加而增加，且该科能发酵多种单糖和二糖等小分子有机物生成产甲烷底物.Exiguobacteraceae在一段成气时间后所占比例减少，到第60 d时几乎消失.
