Vol.41No.1Jan.2021
上海交通大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)
CRISPR/Cas9介导的同源重组在非编码区疾病相关位点功能研究中的应用
徐
宁，周
甜，侯国俊，沈
南，唐元家
上海交通大学医学院附属仁济医院风湿病科，上海市风湿病学研究所，上海200127
［摘要］目的·以全基因组关联研究报道的系统性红斑狼疮相关单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism ，SNP ）位点
rs1978421为例，利用规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR ）/CRISPR associated protein 9，CRISPR/Cas9］系统建立非编码区疾病相关的遗传突变位点功能的研究策略。方法·针对SNP rs1978421位点设计单链导向RNA （single guide RNA ，sgRNA ），利用T7核酸内切酶Ⅰ（T7endonuclea Ⅰ，T7E Ⅰ）实验在HEK293T 细胞中验证sgRNA 对靶点的切割效率。以电穿孔转染的方式将融合Cas9-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）和sgRNA 的表达质粒及同源重组的模板转染至U-937细胞内，通过流式分选得到单个的GFP 阳性U-937细胞，培养14d 后进行基因型鉴定。筛选得到同源重组的细胞克隆后，通过实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR ，qPCR ）对rs1978421上下游2Mbp 范围内的基因及miR-146a 进行定量，分析rs1978421不同等位基因对miR-146a 及其周围基因的表达影响。结果·T7E Ⅰ实验表明，约有24%的HEK293T 细胞中的rs1978421位点发生切割。在U-937细胞内进行的同源重组实验中，共计得到141个细胞株；其中6个同源重组成功，成功率为4.3%。qPCR 结果显示，在野生型TT 与同源重组成功CC 的U-937细胞中，miR-146a 及所检测基因的表达情况均无显著变化（均P >0.05）。结论·SNP rs1978421对其周围2Mb 范围内的基因及miR-146a 并无调控作用，但该研究证明了CRISPR 介导的同源重组技术用于非编码区SNP 位点功能研究的可行性。
［关键词］规律成簇间隔短回文重复序列；同源重组；全基因组关联研究；单核苷酸多态性［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.01.002
［中图分类号］Q3-3
hook
［文献标志码］A
xe什么意思
Application of CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination to the functional study of dia-associated genetic variants located in non -coding region
XU Ning,ZHOU Tian,HOU Guo -jun,SHEN Nan,TANG Yuan -jia
Department of Rheumatology,Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;Shanghai Institute of Rheumatology,Shanghai 200127,China
[Abstract ]Objective ·To take the systemic lupus erythematosus (SLE)-associated single nucleotide polymorphism (SNP)rs1978421reported in the genome-wide association study (GWAS)as an example,and establish the rearch strategy for the functional study of dia-associated genetic variants located in the non-coding region through clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(CRISPR/Cas9)system.Methods ·Single guide RNA (sgRNA)was designed for SNP rs1978421.T7endonuclea Ⅰ(T7E Ⅰ)experiment was ud to verify the cleavage efficiency of sgRNA in HEK293T cells.The homologous recombinant template and expr
ession plasmid of Cas9-green fluorescent protein (GFP)/sgRNA were transfected into U-937cells by electroporation transfection method.GFP positive U-937single cells were sorted by flow cytometry,and the cells were cultured for the following 14days.Then the genotype identification was carried out.After the homologous recombinant cell clones were screened,quantitative real-time PCR (qPCR)was ud to quantify the upstream and downstream genes of rs1978421within 2Mb and miR-146a,and the effects of different alleles of rs1978421on the expression of miR-146a and its surrounding genes were analyzed.Results ·T7E Ⅰassay showed that about 24%of the total rs1978421sites in HEK293T were cleaved.In homologous recombination experiment of the U-937cells,a total of 141cell lines were obtained and only six were successful,while the ratio of homologous recombination was 4.3%.qPCR showed that there was no significant difference in the expression of miR-146a and the detected genes between wild type TT and homologous recombinant CC in the U-937cells (all P >0.05).Conclusion ·SNP rs1978421has no regulatory effect on the surrounding genes within 2Mb and miR-146a.However,this study proves the feasibility of CRISPR-mediated homologous recombination technology for the functional study of SNP sites in the non-coding regions.
[Key words ]clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR);homologous recombination;genome-wide association study (GWAS);single nucleotide polymorphism (SNP)
论著·基础研究
[基金项目]国家自然科学基金（81871287，31630021，31930037）；上海交通大学医学院高水平地方高校创新团队（SSMU-ZDCX20180100）。[作者简介]徐宁（1993—），男，硕士生；电子信箱：**********************。[通信作者]唐元家，电子信箱：************** 。
[Funding Information ]National Natural Science Foundation of China (81871287,31630021,31930037);Innovative Rearch Team of High-Level Local Universities in Shanghai (SSMU-ZDCX20180100).
[Corresponding Author ]TANG Yuan-jia,E-mail:**************.
8
徐宁，等CRISPR/Cas9介导的同源重组在非编码区疾病相关位点功能研究中的应用
全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）报道了许多疾病相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点［1-2］，且进一步研究［3-4］发现这些位点大多位于具有调控活性的非编码区。由于技术手段的限制，对上述位点功能性的验证和机制的研究仅通过大样本相关性分析或双荧光素酶报告系统等较为简单又粗糙的方式进行，尚无法提供能够直接验证SN
P功能的证据［5-6］。然而，规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated protein9，CRISPR/Cas9］基因组编辑系统的出现改变了这一现状［7］。该系统由负责靶向基因组的单链导向RNA （single guide RNA，sgRNA）与负责对基因组切割的Cas9组成。在sgRNA的作用下，Cas9蛋白可诱导靶点DNA序列处形成双链断裂（double-stranded break，DSB），随后经非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR）修复途径分别产生位点敲除/插入或位点重组的细胞株，而这些细胞株则可为疾病易感位点的功能研究提供最直接的证据［8］。
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种复杂的自身免疫病。GWAS报道显示多个SNP位点均与SLE的发生与发展密切相关，但大多数功能未明。因此，利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对这些位点的功能性进行验证可直观地了解其与疾病的关系。研究［9-11］发现，Ⅰ型干扰素信号通路的异常活化是SLE 的重要特征之一，且miR-146a是干扰素信号通路强有力的负调控分子，在SLE患者的单核细胞中异常低表达。GWAS发现SNP rs2431697是SLE的易感位点之一［12］，表达数量性状位点（expression quantitative trait locus，eQTL）分析发现在欧洲人群中rs2431697等位基因的变化会影响miR-146a的表达［13］。故而推测，rs2431697或其连锁位点可能存在对miR-146a的调控作用［14］。借助HaploReg数据库（https：//pubs.broadinstitute/mammals/ haploreg/haplo
reg.php）对rs2431697连锁位点进行分析后发现，SNP rs1978421与之存在强连锁效应（r2=0.94）。而后，本课题组分别对rs2431697与rs1978421SNP处的组蛋白修饰信号进行分析（数据源自ENCODE数据库），结果显示在这2个位点处均探测到常见于转录调节活性区域的组蛋白H3第4位赖氨酸单甲基化（H3K4me1）和组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）修饰信号，故而认为这2个位点都有可能位于具有转录调节活性的DNA元件上，具备参与miR-146a表达调控的能力。因
此，本研究以rs1978421为研究对象，采用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术在单核细胞系U-937中研究该位点是否参与miR-146a的表达调控，并以此来构建研究非编码区疾病相关SNP功能的有效方案。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞株HEK293T细胞和U-937细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。经鉴定，该2种细胞无支原体污染。
1.1.2主要仪器与试剂DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine rum，FBS）以及Opti-MEM无血清培养基（Gibco，美国），电转染系统Neon TM Transfection System、Lipofectamin
e TM2000转染试剂以及TRIzol试剂（Invitrogen，美国），高速冷冻离心机（Eppendorf，德国），TaqMan TM miRNA反转录试剂盒、miR-146a与对照RNU48定量探针、TaqMan TM miRNA定量试剂盒（Thermo，美国），PrimeScript TM RT试剂盒与TB Green®Premix Ex Taq TM试剂盒（TaKaRa，日本），ViiA TM7荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，美国），质粒pSpCas9（BB）-2A-GFP（#PX458；Addgene，美国），细胞株基因型鉴定试剂盒TransDirect®Animal Tissue PCR Kit（北京全式金生物技术有限公司），I-5TM2×High-Fidelity Master Mix（北京擎科生物科技有限公司），FACSAriaⅡ流式分选仪（BD公司，美国），血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养U-937细胞采用含10%FBS的RPMI-1640培养基进行培养，HEK293T细胞采用含10%FBS的DMEM培养基进行培养。培养条件为37℃、5%CO
2
。本实验所用细胞均处于指数生长期，状态良好。
1.2.2U-937野生型rs1978421位点基因型鉴定为获得靶细胞rs1978421位点等位基因同源重组的细胞系，
首先需对U-937细胞rs1978421位点处的碱基类型进行鉴定（该基因型为野生型）。取约2×105个U-937细胞，离心后弃上清液，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。取100ng基因组DNA进行rs1978421位点的PCR扩增，扩增反应采用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix高保真酶反应液进行，反应体系（50μL）如下：模板DNA100ng、引物（10μmol/L）各2.5μL、2×
9
2021,41（1）
上海交通大学学报（医学版）高保真酶反应液25μL 。将各成分混合均匀后短时离心，按照说明书中的条件进行PCR 反应。引物序列见表1，产物长度500bp 。当反应结束后，通过测序公司进行取样并测序。
1.2.3sgRNA/Cas9表达载体的构建选择pSpCas9
（BB ）-2A-GFP 为sgRNA/Cas9的表达载体。将其进行酶切并电泳、回收后，与sgRNA 片段连接。利用IDT 在线sgRNA 设计工具（https ：///site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM ）对sgRNA 进行设计，原则如下：①SNP 位点在sgRNA 序列中。②sgRNA 靶向评分（on-target score ）较高、脱靶评分（off-target score ）较低。基于该原则，我们选取了靶向评分为71分、脱靶评分为0分的sgRNA ，并以单链的形式合成（序列见表2）。将合成的sgRNA 正链与负链在体外复性为双链后，与上述酶切载体于4℃连接过夜，而后行转化实验，次日挑取单菌落进行测序。对测序成功的菌株抽提px458-rs1978421质粒备用。
1.2.4质粒转染于转染前1d 向24孔板加入HEK293T
细胞，每孔2×105个，过夜培养后即可行转染实验。向每孔添加Lipofectamine TM 2000转染试剂2μL ，其余操作均参照说明书进行。当转染结束后，继续培养48h 即可行后续实验。将U-937细胞离心去
培养基后，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，计数后进行分装，即每1.5mL 离心管中加入1.5×106个细胞。离心后弃上清液并用电转缓冲液重悬，加入10μg px458-rs1978421质粒（1μg/μL ）以及30μg 单链DNA 重组模板（序列见表3），电转条件为1400mV 、10ms 、3pul 。在电转后的第12h 加入DNA 连接酶Ⅳ的抑制剂Scr7（终浓度为1μmol/L ），以抑制NHEJ 途径对细胞双链DNA 断裂的修复。1.2.5
T7核酸内切酶Ⅰ实验
收集经px458-rs1978421质
粒转染48h 后的HEK293T 细胞，提取基因组DNA 后经PCR 反应对包含SNP 位点的片段进行扩增。取经纯化后的产物300ng 进行复性，反应体系为15μL ，包含1.5μL T7核酸内切酶Ⅰ（T7endonuclea Ⅰ，T7E Ⅰ）缓冲液；反应条件如下：95℃保持10min ，后以2℃/s 的速度降至85℃，再以0.3℃/s 的速度降至25℃，以25℃保持10s 后正常降温至4℃。待反应结束后，向每管复性产物加入2μL T7E Ⅰ，于37℃孵育1h 后用2%琼脂糖凝胶电泳检测切割效率。切割效率计算公式如下：
切割效率=(
1-
×100%。blowjob
其中，I 500bp 、I 310bp 和I 190bp 分别为500bp 、310bp 和190bp 条带的荧光强度值。1.2.6
RNA 抽提与qPCR 检测
使用TRIzol 法提取
RNA ，以三氯甲烷萃取TRIzol 中的水相，并以异丙醇沉淀其中的RNA ，用75%乙醇洗涤沉淀2次后室温晾干。待RNA 充分干燥后，用20μL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate ，DEPC ）处理水进行溶解并测定浓度，将其浓度统一调至50ng/μL 后利用TaqMan TM miRNA 反转录试剂盒进行miRNA qPCR 模板的制备，并将制备好的模板稀释3倍后再行定量。利用PrimeScript TM RT 反转录试剂盒将提取的总RNA 中的mRNA 反转录为cDNA ，稀释6倍后作为qPCR 的模板。利用TB Green ®Premix Ex Taq TM 试剂盒对稀释后的cDNA 模板进行qPCR 检测。结果以相对表达量2-ΔΔC T
展示。qPCR 引物序列见表4。
1.2.7
细胞分选
U-937细胞转染48h 后即可进行流式
大犰狳
分选。以未转染的U-937细胞作为阴性对照来调节电压及相关参数；将活细胞与单个细胞依次设门圈出，通过调节异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate ，FITC ）通道的电压将阴性对照的细胞集中在横坐标103左侧，即可将转染过的U-937细胞上样；分选FITC 荧光通道横坐标103右侧的FITC 阳性的U-937细胞群至96孔细胞培养板，每孔1个细胞。分选结束后于37℃、5%CO 2培养箱中培养约14d 后即可进行基因型鉴定实验。1.2.8
细胞基因型鉴定
在分选后的第14日，96孔板底
部已有肉眼可见的细胞群落。使用移液器将细胞群落均匀
表1rs1978421位点鉴定引物
oxenTab 1
Indentification
primer of rs1978421locus
rs1978421-F TACTTTTTGGCATCCCTGCT 表2sgRNA 功能序列及单链引物
Tab 2
sgRNA functional quence and single
strand primers
sgRNA functional quence sgRNA-F sgRNA-R
TTTCATTCCATCACCAAGTC caccgTCTCATTCCATCACCAAGTC aaacGACTTGGTGATGGAATGAGAc 表3同源重组模板序列furthermore翻译
Tab 3
Sequence of homologous recombination template
rs1978421HR
CCAAACCTGGGCAACAACCCATAAATACATGTAGCCTT-TTTTTTTTTTCTGAGACAGAGT C TCATTCCATCACCAA-GTCTGGAGTGCAGTGGTGCGATCATGGCTCACTGCAG-CCTGGACC
10
城里老鼠和乡下老鼠
徐宁，等CRISPR/Cas9介导的同源重组在非编码区疾病相关位点功能研究中的应用
地吹打成细胞悬液，吸取5~10μL 至96孔PCR 反应板中，用来制备鉴定基因型的PCR 模板，剩余细胞悬液转至24孔板中继续培养。模板制备采用TransDirect ®Animal Tissue PCR 试剂盒，反应体系为50μL ，包括4~8μL 模板。其余实验步骤按照试剂盒说明书进行。1.3
统计学分析
应用GraphPad Prism 7.0软件对qPCR 数据进行分析。通过非配对t 检验比较野生型与重组型细胞中的对应基因表达的差异。P <0.05表示差异具有统计学意义。
curtain2
结果
2.1
rs1978421位点sgRNA 设计及效率鉴定
利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究非编码区
SNP 位点的功能，具体流程如图1A 。为设计针对rs1978421位点进行同源重组的sgRNA ，我们首先对U-937细胞rs1978421位点处的碱基类型进行鉴定；结果（图1B ）发现在U-937和HEK293T 细胞内，rs1978421位点的等位基因均为胸腺嘧啶（T ）。之后，我们以含有T
等位基因的DNA 片段进行sgRNA 设计及载体px458-rs1978421的构建（图1C ）。成功获得载体后，我们在HEK293T 细胞中对sgRNA 切割效率进行检测。T7E Ⅰ核酸内切酶切割实验结果（图1D ）显示，目的sgRNA 在HEK293T 中rs1978421位点的切割效率约为24%，表明该sgRNA 能够对rs1978421位点进行有效切割，可以应用于同源重组实验。2.2
同源重组细胞株的构建与鉴定
鉴于rs1978421可能与miR-146a 的表达相关，而miR-146a 在HEK293T 中低表达，在U-937中高表达，因此我们选择在U-937细胞中进行同源重组实验。将载体以及同源重组模板通过电穿孔方法转入U-937细胞48h 后，通过流式分选仪将单个绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）强阳性的细胞分选至96孔板中，确保每孔只含有1个细胞。在进行流式分选时发现，活细胞中GFP 阳性的细
胞数占总数的2.29%（图2A ）。经分选共得到960个只含有1个GFP 阳性U-937细胞的培养孔。经2周培养后，有141个细胞增殖至肉眼可见的细胞群落；将rs1978421位点附近的基因组DNA 经PCR 扩增并测序发现，有86个细胞克隆基因为杂合子，占总数的61.0%；有25个细胞基因组未发生改变，占总数的17.7%；有9个细胞在rs1978421位点旁侧检测到不明来源DNA 序列的插入，占总数6.4%；有15个细胞在rs1978421旁侧发生不同数目碱基删除，占总数的10.6%；另有6个细胞rs1978421位点的碱基成功由胸腺嘧啶（T ）转变为胞嘧啶（C ），重组成功细胞数占总数的4.3%（图2B 、C 和表5）。2.3
rs1978421不同等位基因对周围基因表达影响rs1978421位于5号染色体PTTG1基因下游约27.4×103bp 以及miR-146a 的初级转录本miR3142HG 上游约12.1×103bp 处，其邻近2Mbp 区域内的基因包括SLU7、TTC1、PWWP2A 等（图3A ）。为了检测rs1978421位点的调节基因，我们首先采用qPCR 法检测miR-146a 在不同基因型细胞中的表达水平；结果（图3B ）显示，与TT 基因型相比，在CC 型、SNP 位点邻近序列切除8bp 以及SNP 位点邻近序列插入65bp 的细胞克隆中，miR-146a 表达无差异。同时，对rs1978421邻近的高表达基因检测表明，不同基因型对这些基因的表达也无显著影响（图3C ）。基于以上数据，我们认为rs1978421位点可能不是一个具有功能性的调节位点。
表4qPCR 引物序列Tab 4
qPCRroundtrip
primers
GAPDH -F GAPDH -R PTTG1-F PTTG1-R SLU7-F SLU7-R TTC1-F TTC1-R PWWP2A -F PWWP2A -R UBLCP1-F GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG ACCCGTGTGGTTGCTAAGG ACGTGGTGTTGAAACTTGAGAT AAGAACAGCGAAAATTGGGCA CCCTCTTGTACCATTCTCCAGA GAGCGGACAAGGTTGAGAACA CTCCTCCTTTAGTCTAGTGCTCT CTTGTCGTGTCGTTCCGCTT ACCATTTGCTTCACACTTGACTT CTCGCAGAGTGAAAGAGTACAAA Note:GAPDH —Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena;PTTG1—Homo sapiens pituitary tumor-transforming 1;SLU7—Homo sapiens SLU7homolog splicing factor;TTC1—Homo sapiens tetratricopeptide repeat domain 1;PWWP2A —Homo sapiens PWWP domain containing 2A;UBLCP1—Homo sapiens ubiquitin-like domain containing CTD phosphata 1.
11
12
上海交通大学学报（医学版）
2021,41（1）
团委书记竞聘
Note：A.Schematic diagram of the rearch strategy for SNP located in non-coding region.B.Wild type U-937SNP rs1978421genotype identification(rever primer-mediated quencing).C.pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid element instructions(NLS—nuclear location signal).D.T7EⅠexperiments for sgRNA cutting efficiency test in HEK293T cells(M—marker;FI—fluorescence intensity).
图1非编码区SNP位点研究策略及rs1978421位点sgRNA设计及切割效率检测
Fig1Rearch strategy for SNP located in non-coding region and rs1978421sgRNA design and cutting efficiency test
