作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(9): 2221 2227 zwxb.chinacrops/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail:***************
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.11085
基因聚合选育抗赤霉病小麦新品系百农4299
张一铎1李国强1孔忠新1王玉泉2李小利2茹振钢2贾海燕1,*
马正强1
claimed
1 南京农业大学作物基因组学与生物信息学中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095;
2 河南科技学院小麦中
心, 河南新乡 453003
摘要: 小麦赤霉病是一种严重危害小麦生产的真菌性病害, 其抗性由多基因控制, 抗性机制复杂。type I (抗侵入)
和type II (抗扩展)是小麦抵御赤霉病侵害的2种最主要抗性类型。在抗赤霉病育种中兼顾2种抗性, 对于保证生产
上抗性的稳定和持久有着重要意义。在前期研究中, 作者所在课题组从小麦地方品种望水白中克隆了抗赤霉病扩展
的主效QTL Fhb1, 精细定位了Fhb4和Fhb5, 获得了功能性/紧密连锁的分子标记。本研究利用这些标记, 以小麦品
系NMAS022作为供体亲本, 现代小麦品种百农4199作为受体亲本, 通过分子标记辅助回交育种方法选育成了聚合
望水白Fhb1、Fhb4、Fhb5的小麦新品系百农4299。与百农4199相比, 百农4299在2年的田间试验中type I抗性
至少增加了73%~74%, type II抗性至少增加了83%~88% (以病小穗数计), 并且产量潜力也得到了提高。上述结果证
明了通过分子标记辅助选择聚合不同类型抗赤霉病QTL以提高小麦赤霉病抗性的可行性。抗赤霉病小麦品系百农
soccer4299有望成为一个新的抗赤霉病小麦品种。
关键词：小麦; 赤霉病; 抗病基因聚合; MAS; 百农4299
Breeding of FHB-resistant wheat line Bainong 4299 by gene pyramiding
ZHANG Yi-Duo1, LI Guo-Qiang1, KONG Zhong-Xin1, WANG Yu-Quan2, LI Xiao-Li2, RU Zhen-Gang2, JIA
Hai-Yan1,*, and MA Zheng-Qiang1
1 Crop Genomics and Bioinformatics Center, State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095, Jiangsu, China; 2 Center of Wheat Rearch, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 450003, Henan, China
Abstract: Fusarium head blight(FHB) is a devastating fungal dia in wheat production. Wheat FHB resistance is controlled by
multiple genes and has complicated resistance mechanisms. Type I (resistance to invasion) and type II (resistance to expansion)
are two main resistance types of wheat against FHB. Combining both types of FHB resistance in breeding is vitally important for
the resistance durability and stability of cultivars. In fine mapping and cloning of type I resistance QTL Fhb4 and Fhb5 and type II
resistance QTL Fhb1 in wheat landrace Wangshuibai, functional/tightly-linked molecular markers for them had been obtained. In
this study, a new wheat line named Bainong 4299 was bred after introduction of the QTL from NMAS022 with the help of the
markers and using modern wheat variety Bainong 4199 as the recipient parent. Compared with Bainong 4199, Bainong 4299 in-
cread type I resistance by at least 73% to 74% and type II resistance by 83% to 88% increa (in terms of the number of dis-
ead spikelets per spike) in two field trials. Moreover, its yield potential had moderate elevation. In conclusion, this study pro-
vided another successful illustration of marker-assisted lection and pyramiding of FHB QTL in improving wheat FHB resistance.
joopBainong 4299 had the potential to become a new FHB resistance cultivar.7的英文
Keywords: wheat; Fusarium head blight; pyramiding of resistance genes; MAS; Bainong 4299
本研究由国家重点研发计划项目(2016YFD0101802), 国家自然科学基金项目(31930081, 30430440)和现代作物生产(省部共建)协同创
新中心资助。
This study was supported by the National Key Rearch and Development Program of China (2016YFD0101802), the National Natural Sci-
ence Foundation of China (31930081, 30430440), and the Collaborative Innovation Initiative for Modern Crop Production.
*通信作者(Corresponding author): 贾海燕,E-mail:**************
第一作者联系方式:E-mail:*******************
Received (收稿日期): 2021-09-29; Accepted (接受日期): 2021-11-29; Published online (网络出版日期): 2021-12-27.
URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20211224.1821.004.html
2222作物学报第48卷
小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是世界范围内严重危害小麦生产安全的一种真菌性病害[1]。赤霉病的发生不但会导致小麦产量和品质的下降, 病菌繁殖过程中产生的真菌毒素还会在籽粒中积累, 进而危害人类和动物的健康[2]。在我国, 长江中下游麦区和东北春麦区是赤霉病主要的流行区域[3]。近年来, 随着全球气候变暖以及栽培和耕作措施的改变, 小麦赤霉病在我国黄淮冬麦区的流行愈发频繁, 并向西部地区扩展。2012年, 全国小麦赤霉病发生面积达1000万公顷[4], 约占当年小麦种植面积的41%。抗病品种的培育和推广是抵御小麦赤霉病危害最为经济、安全、有效的途径, 能够为小麦赤霉病的综合防治提供有效保障。
小麦对赤霉病的抗性是多基因控制的数量性状, 机制十分复杂[1]。根据表现形式的不同, 小麦的赤霉病
抗性分为五种类型, 包括type I (抗赤霉菌穗部初侵染)、type II (抗赤霉菌穗部扩展)、type III (抗籽粒中毒素积累)、type IV (低病粒率)和type V (低产量损失)[5-7]。其中, type I抗性和type II抗性是小麦抵御赤霉病菌侵害的2种最主要抗性。已经正式命名的7个抗赤霉病基因(Fhb1~Fhb7)均与type I或type II抗性的增强相关[8-14]; Fhb1、Fhb4、Fhb5和Fhb7还被报道与type III或type IV抗性的增强有关[15-22]。在育种过程中单纯通过表型选择进行赤霉病抗性改良十分困难。Fhb1是公认的效应最强且最稳定的type II抗赤霉病QTL。美国、加拿大等发达国家已经通过分子标记辅助选择的方法利用Fhb1育成了一批赤霉病抗性显著提高的小麦品种[23]。但是, 同时提高type I和type II两种抗性的QTL聚合目前尚未在育种中得到广泛应用。
黄淮麦区是我国小麦的主产区, 也是我国的主要“粮仓”, 其小麦产量和品质直接关系到我国的粮食安全和食品安全。然而, 该区域目前缺乏具有稳定抗性的抗赤霉病种质。在前期研究中, 本单位从望水白中克隆了抗赤霉病扩展的主效QTL Fhb1[24], 并对其基因组中的抗扩展主效QTL Fhb2、抗侵入主效QTL Fhb4和Fhb5进行了精细定位[11-12,25]。在绵阳99-323背景的近等基因系中, Fhb1、Fhb4、Fhb5均能显著增强材料的赤霉病抗性[26]。为了创制适用于黄淮麦区赤霉病抗源材料, 本研究利用我国现代小麦品种百农4199作为轮回亲本, 通过分子标记辅助回交的方法选育出聚合望水白Fhb1、Fhb4、Fhb5的小麦品系百农4299。在多年多点的田间试验中, 百农4299表现出良好的赤霉病抗性和农艺性状。
1材料与方法
1.1植物材料
NMAS022是本单位以小麦品系PH691为受体亲本选育的抗赤霉病近等基因系, 聚合了来自望水白的抗赤霉病主效QTL Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5, 半冬性、高抗赤霉病, 作为抗赤霉病QTL的供体亲本。百农4199是由河南科技学院选育的半冬性小麦品种, 高感赤霉病, 用作轮回亲本[27]。
1.2DNA提取和基因型检测
样品的基因组DNA参照Ma和Sorrells[28]的方法从幼嫩的叶片中进行提取。Fhb1使用基于其序列开发的功能标记WGRB619进行检测[24]。Fhb4的检测使用紧密连锁的旁侧标记GWM149和GWM513[11]; Fhb5的检测使用紧密连锁的旁侧标记MAG9482 (F: 5'-CATGATTGATTCGATGACTATAAT ATCTT-3', R: 5'-TCTTTCTCCCGTTGCAATGT-3')和WMC752 (未发表结果)。
PCR反应体系总体积12.5 μL, 包含10~30 ng DNA模板, 10× PCR buffer (含Mg2+) 1.25 μL, 10 mmol L–1 dNTP 0.25 μL, 10 μmol L–1正向引物和反向引物各0.2 μL, Taq酶0.4 U。PCR反应程序为: 94℃预变性5 min, 94℃变性30 s、52~60℃退火30 s (退火温度因引物而异)、72℃延伸2 min (WGRB619)或40 s (其余标记)循环36次, 最后72℃延伸5 min。其中, MAG9482和GWM149的退火温度分别为52℃和54, WGRB619
℃、GWM513和WMC752的退火温度为60℃。WGRB619的扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离, 经EB染色后在紫外光下观察; 其余标记的扩增产物通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物, 经银染法显色观察[29]。1.3田间试验
百农4299和试验对照材料于2019—2021年种植于江苏省淮安市江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所科研基地, 2020—2021年种植于江苏省南京市江苏省农业科学院六合科研基地。百农4299和对照材料在所有的试验中均种植为邻近的小区, 采用常规的田间管理, 且种植期间不进行赤霉病的防治。2019—2020年百农4299和百农4199在淮安试验点各种植5行, 行长3 m, 行距0.25 m, 每行播种90粒; 2020—2021年百农4299和百农4199在淮安各种植为长6.5 m、宽1.7 m的小区, 播量为270万株 hm–2;
第9期
张一铎等: 基因聚合选育抗赤霉病小麦新品系百农4299 2223
2020—2021年百农4299和百农4199在南京各种植2个重复, 每个材料种植为长6 m 、宽2 m 的小区, 播量为210万株 hm –2。
1.4 赤霉病抗性鉴定
type I 抗性采用喷雾法进行接种。在开花期对试验材料喷洒浓度为每微升1个孢子的赤霉菌混合孢子菌液。14 d 后在接种区域中随机选取85~125个穗子进行调查, 其中被赤霉菌侵染的穗子所占的百分比记为病穗率作为type I 抗性的评价指标。
type II 抗性采用单花滴注法进行接种。在开花期向试验材料穗子中部正在开花的一朵小花中注射10微升赤霉菌混合孢子菌液(浓度为每微升100个孢子), 每个小区接种20个穗子。18 d 后在小区中选取最感病的10个穗子调查病小穗数和病轴长作为type II 抗性的评价指标。
赤霉病严重度为每个试验小区病穗率与病小穗数的乘积, 用于综合抗性的评价。
1.5 农艺性状和产量鉴定
株高、主穗粒数、单株穗数的调查在小麦成熟期进行, 从每个小区中部随机选取10个单株采集数据, 以排除边际效应的影响。材料成熟后, 从小区中部以1 m 2为单位收获材料, 脱粒、干燥后进行产量和千粒重的测量。
1.6 表型数据统计分析
使用t -test 对试验材料的表型数据进行比较。
2 结果与分析
2.1 百农4199中Fhb1、Fhb4、Fhb5的检测
使用Fhb1的功能标记WGRB619、Fhb4紧密连锁的旁侧标记GWM149和GWM513、Fhb5紧密连锁的旁侧标记MAG9482和WMC752对高感赤霉病的小麦品种百农4199进行检测, 均未在百农4199中扩增出望水白类型的目标片段(图1), 说明百农4199的基因组中不含有Fhb1、Fhb4和Fhb5。
图1 百农4199、NMAS022、百农4299中Fhb1、Fhb4、Fhb5标记检测结果
Fig. 1 Detection of Fhb1, Fhb4, and Fhb5 in Bainong 4199, NMAS022, and Bainong 4299
M: DNA marker, 图片左侧的数字为条带分子量大小(单位: bp); 1: 百农4199; 2: NMAS022; 3: 百农4299; 望水白类型的目标条带分别在图中用箭头标出, 图片下方分别为引物名称。
M: DNA marker. Band sizes are on the left of each picture (unit: bp); 1: Bainong 4199; 2: NMAS022;
3: Bainong 4299. The target bands of Wangshuibai type are marked with arrows respectively, and primer names are at the bottom of each picture.
2.2 百农4299的选育
小麦品系百农4299以百农4199为母本和轮回亲本, NMAS022为父本和抗赤霉病QTL 的供体, 通过人工杂交和分子标记辅助回交的途径进行选育(图2)。在每一个回交分离世代, 均通过分子标记辅助选择的方式成功获得了多个聚合Fhb1、Fhb4和Fhb5的植株, 并根据材料的表型选择农艺性状较好的植株进行回交或自交。在BC 3F 2群体中, 再次通过分子标记辅助选择的方法获得了Fhb1、Fhb4和Fhb5纯合的植株。由于材料的回交世代较低, 其后代农艺性状仍然存在分离。因此继续根据材料的田间表现连续进行了2代单株选择, 最终获得了综合性状良好的小麦品系百农4299。分子标记检测的结果显示, Fhb1、Fhb4、Fhb5在单株选择的过程中均未丢失(图1)。
2.3 赤霉病抗性鉴定
在2019—2020年江苏淮安和2020—2021年江苏南京进行的赤霉病抗性鉴定中(表1), 百农4199均表现出严重的赤霉病症状, 其赤霉病严重度平均值为2.84。百农4299在相同环境中则表现出良好的赤霉病抗性, 在2个环境中的赤霉病严重度平均值为0.11, 相比百农4199降幅高达96.1%。在type I 抗性方面, 百农4299的病穗率相比百农4199下降了28.3%~30.8%, 平均降幅73.2%; 在type II 抗性方面, 百农4299
的病小穗数和病轴长相比百农4199分别降低了4.8~7.2和3.3~3.5 cm, 平均降幅分别为85.3%和82.9%。在所有的赤霉病抗性鉴定中, 百农4299与百农4199在病穗率、病小穗数和病轴长上的差异均达到极显著水平(P <0.01)。根据以上多年多点的赤霉病抗性表现可以看出, 相比轮回亲本, 百农4299的赤
anatomy2224
作 物 学 报 第48卷
霉病type I 抗性和type II 抗性均得到显著提升(图3)。 2.4 主要农艺性状及产量表现
在2019—2020年江苏淮安、2020—2021年江苏淮安和2020—2021年江苏南京的田间试验中, 百农4299均具有较好的农艺性状表现(表2)。在不同的环
境中, 百农4299均表现出与轮回亲本较为接近的株高, 其千粒重也在2个环境中相比轮回亲本显著升高。在产量表现上, 百农4299在3个环境中均显著高于轮回亲本, 每平方米产量与百农4199相比增加1.8%~6.1% (表2)。
图2 百农4299的选育过程(a)及其供体亲本NMAS022 (b)
Fig 2 Breeding process of Bainong 4299 (a) and its donor parent NMAS022 (b) n : 群体大小; 图片(b)拍摄于2020年5月4日, 江苏淮安。
n : population size; The picture (b) was taken on May 4, 2020 in Huai’an, Jiangsu province, China.
表1 百农4299及其轮回亲本的赤霉病抗性鉴定结果
Table 1 FHB resistance identification of Bainong 4299 and its recurrent parent
环境 Environment 材料 Material
赤霉病严重度FHB verity 病穗率 Percentage of in-fected spikes (%) 病小穗数 Number of dis-ead spikelets 病轴长 Length of diad rachides (cm) 百农4199 Bainong 4199 2.23±0.11
38.5±1.8
5.8±0.6
4.1±0.5
2019–2020淮安 2019–2020 Huai’an 百农4299 Bainong 4299 0.10±0.02** 10.2±2.2** 1.0±0.0** 0.8±0.
1** 百农4199 Bainong 4199 3.44±0.14
42.3±2.1
8.2±0.1
4.1±0.1
2020–2021南京 2020–2021 Nanjing
百农4299 Bainong 4299
0.11±0.01** 11.5±1.3** 1.0±0.0** 0.6±0.0**
**表示在相同环境中与百农4199在P = 0.01水平差异显著.
**
indicates the significant differences with Bainong 4199 in the similar environment at P
= 0.01.
图3 百农4299 (左)及其轮回亲本百农4199 (右)在田间自然发病状态下的赤霉病抗性表现
Fig. 3 Fusarium head blight symptom illustration of Bainong 4299 (left) and its recurrent parent Bainong 4199 (right) in the field under natural condition
图片拍摄于开花后21 d, 2021年江苏南京。
Photos were taken 21 days after anthesis in 2021 in Nanjing, Jiangsu province, China.
第9期张一铎等: 基因聚合选育抗赤霉病小麦新品系百农4299 2225
表2百农4299及其轮回亲本的农艺性状和产量鉴定结果
Table 2 Agronomic traits and yield identification of Bainong 4299 and its recurrent parent
环境Environment
材料
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Material
株高
molten
Plant height
(cm)
穗粒数
No. of kernelsbux
per spike
单株穗数
No. of spikes
per plant
千粒重
longoria
1000-kernel
weight (g)
1 m2产量
Yield per square
meter (g)
百农4199 Bainong 4199 80.2±1.2 54.4±1.8 12.1±0.6 44.2±0.4 984.5±3.5
2019–2020淮安
2019–2020 Huai’an 百农4299 Bainong 4299 84.2±0.9**55.0±1.9 12.0±0.9
48.4±0.5** 1002.0±4.2*
百农4199 Bainong 4199 82.0±1.2 42.3±1.6 4.4±0.8 46.3±0.4 845.9±5.8 2020–2021淮安
2020–2021 Huai’an 百农4299 Bainong 4299 86.9±1.7**39.0±1.6** 5.3±1.2 44.7±0.2** 874.8±3.4*
百农4199 Bainong 4199 72.6±1.8 42.5±0.8 3.8±0.1
41.5±0.2 490±5.2
2020–2021南京
2020–2021 Nanjing 百农4299 Bainong 4299 72.0±1.2 37.1±1.1** 4.6±0.3 42.8±0.2** 520±4.7*
fuck off
*和**分别表示在相同环境中与百农4199在P=0.05和P=0.01水平显著。
* and ** indicate the significant differences with Bainong 4199 in the similar environment at P=0.05 and P=0.01, respectively.
3讨论
本研究中选育的小麦品系百农4299不但携带有type II类型的抗赤霉病QTL Fhb1, 还同时聚合了type I类型的抗赤霉病QTL Fhb4和Fhb5。在连续2年的赤霉病抗性鉴定中, 百农4299均表现出稳定良好的赤霉病抗性。相比轮回亲本, 百农4299的type II抗性和type I抗性均获得了大幅提升, 在综合抗性上平均增幅高达96.1%, 说明将提供type I抗性的QTL与Fhb1聚合能够获得更强的赤霉病抗性。Fhb1是目前已知效应最强也是育种中使用最广泛的抗赤霉病QTL, 在赤霉病发生时可以有效抑制赤霉菌在穗部的扩展从而降低赤霉病造成的危害。仅携带Fhb1的小麦材料在种植的过程中, 不具有抗赤霉病初侵染能力, 同样会产生病粒, 造成DON毒素含量超标(数据未发表)。许峰等[30]在矮抗58的回交后代中同样观察到不同抗性类型的抗赤霉病QTL聚合以后比单个QTL的抗赤霉病效果更强的现象。李静静等[31]利用苏麦3号和
中感赤霉病的小麦品系979-5作为杂交亲本选育出20个小麦品系, 其中13个仅携带Fhb1的品系对赤霉病表现中抗, 7个聚合Fhb1和Fhb5或聚合Fhb1、Fhb2和Fhb5的品系对赤霉病表现高抗。在刘建军等[32]的研究中, 聚合多个抗赤霉病QTL的品系也比仅含有1个抗赤霉病QTL 的品系展现出更加优秀的赤霉病抗性。因此, 在抗赤霉病育种中应该注重不同类型抗赤霉病QTL的聚合使用。
本研究中使用的抗赤霉病QTL供体亲本NMAS022虽然高抗赤霉病, 但是株高较高, 在育种中不易被接受; 在2019—2020年江苏淮安的环境中, 其平均株高高达145.5 cm[27]。在相同年份, 百农4299在淮安试验中的平均株高仅84.2 cm (表2), 相比NMAS022得到显著改善。从产量来看, 改良后的新品系百农4299高于百农4199, 这可能跟在种植过程中没有进行赤霉病防控有关。尽管在测产区, 我们没有进行赤霉菌接种, 但是种植地点江苏具有赤霉病自然发病的条件。因此, 不能排除百农4299的产量高于百农4199是与4299的较高的赤霉病抗性有关这个可能性, 严格的测产实验应该对主要病害进行药剂防控。没有药剂防控的条件下的产量数据体现了自然条件下真实的产量水平。
近年来, 随着赤霉病在国内流行范围的扩大, 黄淮麦区的小麦生产所面临的赤霉病防控形势愈发严峻。本研究中使用的轮回亲本百农4199目前是黄淮麦区大面积推广的小麦品种, 具有良好的农艺性状和产量表现, 但是高感赤霉病。利用分子标记辅助回交的方法并结合对农艺性状的表型选择, 本研究在BC3代便获得了具有良好赤霉病抗性和农艺性状表现的小麦品系百农4299, 证明了抗赤霉病QTL的分子标记辅助选择在提升黄淮麦区小麦材料赤霉病抗性方面的有效性。百农4299的成功选育为我国小麦材料
的赤霉病抗性改良奠定了物质基础, 并且在育种过程中具有重要的参考价值。
4结论
通过分子标记辅助选择聚合不同类型的抗赤霉病QTL有助于在育种中获得良好的赤霉病抗性。聚合望水白Fhb1、Fhb4和Fhb5的小麦品系百农4299与轮回亲本相比在type I抗性和type II抗性具有显著提升, 并且具有良好的农艺性状表现和产量潜力, 有望成为一个新的抗赤霉病小麦品种。
