⾻与软组织肿瘤⼆代测序中国专家共识（2021年版）
⾻与软组织肿瘤属于罕见肿瘤，恶性⾻肿瘤仅占所有恶性肿瘤的0.2%，软组织⾁瘤在成⼈恶性实体瘤中所占⽐例也不⾜1%[1-3]。由于该病亚型众多，且⾁瘤性病变恶性程度⾼、预后差，给临床诊治带来巨⼤挑战[4-6]。近年来，⾻与软组织肿瘤的分⼦遗传学发展⼗分迅速，不仅在临床病理诊断中起着⾮常重要的作⽤，⽽且在协助临床制定治疗策略和预测⽣物学⾏为等⽅⾯也具有重要价值[6-7]。随着新的分⼦检测⼿段的开展和应⽤，基于特定基因异常的新病种也在不断涌现，以往⼀些分化不明或未分化的肿瘤经过分⼦检测也得到了重新认识，⾻与软组织肿瘤分类的基础正在从形态学分类转向分⼦分类。
⼆代基因测序（next-generation quencing，NGS）能⼀次对⼏⼗万⾄⼏百万条DNA序列⽚段/读长进⾏测序分析，从⽽识别基因变异，⽬前已⼴泛应⽤于肿瘤的分⼦诊断、靶向基因筛选以及表观遗传学分析等领域。近年来，国内外已发表了多个NGS检测技术指南，如《⼆代测序诊断指南》《基于⼆代测序的肿瘤panels验证指南》等，但上述指南通常以检验科室的技术参数标准为主，尚缺乏可指导NGS检测在⾻与软组织肿瘤临床诊疗路径中的应⽤共识。因此，由中国抗癌协会⾁瘤专业委员会牵头，组织⾏业内资深专家共同商讨并撰写了本共识，旨在规范NGS检测在⾻与软组织肿瘤领域内的应⽤，更好地服务于临床诊治，使患者受益。
1. ⾻与软组织肿瘤的诊断
夏奇拉好听的歌⾻与软组织肿瘤的病理诊断⽬前仍基于传统的形态学观察，辅以免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）标记。近年来，⼴泛开展的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和基因突变检测（⼀代测序）为⾻与软组织肿瘤的病理诊断提供了极⼤帮助，部分通过细胞和分⼦遗传学研究发现的基因变异也已成为⼴泛应⽤的分⼦诊断指标，如采⽤FISH检测滑膜⾁瘤中的SS18基因易位、尤⽂⾁瘤中的EWSR1基因易位以及⾼分化和去分化脂肪⾁瘤中的MDM2、CDK4基因扩增等；采⽤⼀代测序检测胃肠道间质瘤中的KIT/PDGFRA基因突变、侵袭性纤维瘤病中的CTNNB1基因突变、梭形细胞/硬化性横纹肌⾁瘤中的MYOD1基因突变以及⾻巨细胞瘤中的H3F3A基因突变等[6，8-9]。随着分⼦检测技术的不断开展和推⼴，以NGS为代表的新型检测技术
在⾻与软组织肿瘤的诊治和预后判断中将会发挥越来越重要的作⽤[10]。
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共识1：推荐常规病理学检查不能明确诊断的⾻与软组织肿瘤患者进⾏NGS检测
临床实践中，部分⾻与软组织肿瘤难以通过IHC、FISH等常规病理检查确诊，此时需要借助NGS检测来鉴别是否存在分⼦遗传学异常，从⽽辅助病理诊断。如既往诊断的⾻与软组织⼩圆细胞未分化⾁瘤中⼀些类型经NGS检测发现分别存在CIC基因重排、BCOR-CCNB基因融合以及BCOR-内部串联重复（internal tandem duplications，ITD）突变，根据相对特异性的分⼦遗传学改变，正式命名为CIC重排⾁瘤和伴有BCOR遗传学改变⾁瘤[11-12]。⼀些共表达CD34和S-100
蛋⽩的梭形细胞肿瘤，因形态和免疫表型有重叠，通过常规病理学⼿段难以做出⼗分明确的诊断，但通过NGS检测发现这些⾮常相似的肿瘤分别发⽣了NTRK1/2/3、BRAF、RAF1和RET等基因重排[13]，可采⽤基因名称进⾏命名诊断，如NTRK重排梭形细胞肿瘤、BRAF重排梭形细胞肿瘤、RAF1重排梭形细胞肿瘤或RET重排梭形细胞肿瘤等。此外，对于基因突变不明的病例，NGS检测效率明显优于多个探针的FISH检测。推荐采⽤NGS检测辅助病理诊断的⾻与软组织肿瘤类型见表1，其中⼀些病变类型为新近报道的病种，如GLI1遗传学改变的恶性上⽪样肿瘤[14]，有待更多的病例积累。
需要说明的是，尽管NGS检测基本涵盖所有的分⼦改变，但并⾮所有的辅助病理诊断和适合靶向治疗的⾻与软组织肿瘤均需要进⾏NGS检测。⼀些肿瘤类型中的分⼦异常可通过常规的分⼦检测进⾏诊断，
如⾻巨细胞瘤中的H3F3A基因突变、胃肠道间质瘤中的KIT、PDGFRA基因突变和侵袭性纤维瘤病中的CTNNB1基因突变等⽬前仍以⼀代测序为主；⾮典型性脂肪瘤样肿瘤/⾼分化脂肪⾁瘤/去分化脂肪⾁瘤中的MDM2、CDK4基因扩增和炎性肌纤维母细胞瘤中的ALK基因重排可通过FISH检测进⾏辅助诊断和指导靶向治疗。此外，对于⼀些通过常规光镜观察或IHC检测可确诊的肿瘤类型，虽涉及有靶标的分⼦改变，但⽆需再进⾏分⼦检测，如隆突性⽪肤纤维⾁瘤和腺泡状软组织⾁瘤可通过常规病理确诊，⽆需进⾏PDGFB、TFE3基因重排加以验证；TFE3 IHC标记阴性（排除TFE3重排型）的⾎管周上⽪样细胞肿瘤（perivascular epithelioid cell tumors，PEComa）⽆需进⾏TSC1/2基因突变检测；形态典型的上⽪样⾁瘤在
INI1（SMARCB1）IHC标记获得确诊后⽆需进⾏SMARCB1基因突变或缺失检测。
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共识2：推荐常规分⼦学检测结果为阴性的⾻与软组织肿瘤患者使⽤（DNA+RNA）NGS技术或平台进⾏复检
华为回应美国指控传统基因检测⽅法因实⽤性⾼和单次检测成本较低⽽⼴泛应⽤于临床，但也存在⼀些技术缺陷和临床应⽤局限（表2）[15-16]。相⽐之下，NGS检测在技术和临床诊疗中具有⼀定优势：1）可以同时涵盖数百个基因，检测范围更⼴；2）同时检测所有位点的多种变异类型，避免遗漏某些变异类型，可为初诊患者提供完整的精准分型及治疗策略指导；3）可以评估肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）等免疫治疗相关的分⼦标志物[17-18]；4）避免单基因检测带来的样本耗竭和时间延误，可以快速地为后续评估提供依据。因此，建议传统检测为阴性的样本使⽤NGS复检。当患者出现疾病进展时，可再次进⾏全⾯的基因检测，有助于发现潜在的耐药机制和新的标靶，为下⼀步治疗⽅案的选择提供依据。
基因融合是⾻与软组织肿瘤常见的变异形式。在⽬前报道的近10 000个基因融合中，约90%通过NGS⽅法鉴定，包括DNA测序（DNA-q）和RNA测序（RNA-q）。越来越多的研究表明，RNA-q是DNA-q的补充，能检测到DNA-q未检测到的融合[19]。原因可能在于：1）基因内含⼦序列冗长和存在重复序列，DNA探针难以全⾯覆盖；2）携带融合变异的肿瘤细胞占⽐低，低于检测DNA的灵敏度；3）复杂的转录或转录后的剪接加⼯过程可能会影响基因组融合/重排的真实性[20-22]。因此，推荐使⽤DNA-q联合RNA-q的技术进⾏复检。
共识3：推荐常规分⼦学检测与NGS检测有差异的⾻与软组织肿瘤患者，考虑第3种检测进⾏验证
在分⼦病理学诊断过程中，会出现常规分⼦学检测与NGS检测结果不⼀致的情况，如FISH检测某种基因重排阴性但经NGS检测发现有涉及该基因的融合基因，或涉及其他少见的融合基因亚型；FISH检测某基因重排阳性但NGS未检出相对应的融合基因，此时可采⽤逆转录聚合酶链反应（rever transcription-polymera chain reaction，RT-PCR）等第3种检测技术进⾏验证，或送⾄其他权威机构进⾏复检，⽐对检测结果，以达到精准诊断的⽬的。
2. ⾻与软组织肿瘤的治疗
2.1 靶向治疗
共识4：推荐考虑接受特异性靶向治疗的⾻与软组织肿瘤患者，通过NGS技术或平台验证靶向药物相关的基因或潜在基因
恶性⾻与软组织肿瘤化疗进展后治疗⼿段较局限，近年来靶向药物的疗效逐步在⾁瘤的临床试验与实践中得到了验证，部分药物获批适应证，部分药物被指南推荐，部分药物仍在临床试验阶段。靶向治疗通常⽤于不可切除或晚期⾻与软组织肿瘤的⼆线治疗，但特定的靶向药物可以考虑⽤于特定类型不可切除或晚期⾻与软组织肿瘤的⼀线治疗。⽬前，可以使进展期患者获益的靶向药物见表3[23-31]。
鉴于⾁瘤病理的复杂性，临床在使⽤此类特异性的靶向药物之前有必要⾏NGS检测进⾏靶点基因验证，如NTRK抑制剂被批准应⽤于NTRK基因融合的⾁瘤[23，32]；EZH2抑制剂被批准应⽤于上⽪样⾁瘤，在其他INI1基因缺失的⾁瘤临床试验中也取得⼀定疗效[25，33]；CDK4/6抑制剂在去分化脂肪⾁瘤临床试验中取得了⼀定疗效[26-27]；ALK抑制剂可⽤于ALK融合阳性的炎性肌纤维母细胞瘤[28]；PDGFR抑制剂对隆突性⽪肤纤维⾁瘤有效[34]。
此外，抗⾎管多靶点类药物的靶点主要为⾎管内⽪⽣长因⼦受体（vascular endothelial growth factor
receptor，VEGFR）及其他酪氨酸激酶。在⾻与软组织肿瘤中，如安罗替尼已获得中国国家药品监督
管理局（NMPA）批准，帕唑帕尼获得美国⾷品药品监督管理局（FDA）批准，瑞⼽⾮尼⽤于⾮特异性组织学亚型软组织⾁瘤（⾮脂肪⾁瘤）获得《NCCN软组织⾁瘤临床实践指南》推荐[6]；重组⼈⾎管内⽪抑制素获得《2018CSCO经典型⾻⾁瘤诊疗指南》推荐。⽬前尚未有直接证据显⽰VEGFR等基因状态与治疗效果有明确的关系，故采⽤此类治疗⽅案可以不进⾏NGS检测。
对于⽆有效或者更好治疗⼿段的进展期⾁瘤患者，可尝试通过NGS检测寻找潜在的药物靶点，在取得患者明确知情同意后，可以采⽤药品说明书中未明确但具有循证医学证据对靶点阳性的患者进⾏治疗。
2.2 免疫治疗
初二上册英语单词共识5：推荐进展期⾻与软组织肿瘤患者，分别采⽤IHC和NGS检测程序性死亡因⼦配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、MSI、TMB等免疫治疗相关分⼦标志物，根据结果辅助免疫治疗
随着免疫检查点抑制剂在多种肿瘤中被证实有效，免疫治疗在软组织⾁瘤中的应⽤也⽇益得到重视。⼀项关于晚期⾻与软组织⾁瘤的亚型扩展试验发现，帕博利珠单抗治疗未分化多形性⾁瘤和去分化脂肪⾁瘤的ORR分别达到23%和10%，提⽰帕博利珠单抗在未分化多形性⾁瘤治疗⽅⾯具有⼀定临床疗效[35]。纳武利尤单抗单⽤治疗转移性⾁瘤的ORR仅为5%，但联⽤伊匹单抗后ORR增⾄16%，提⽰
纳武利尤单抗联合伊匹单抗可能在某些⾁瘤亚型治疗⽅⾯具有⼀定潜⼒[36]。⽽寻找合适的分⼦标志物有助于指导分⼦亚型分类，筛选优势⼈群，从⽽使⾁瘤免疫治疗更加精准。
dispute⽬前，临床常⽤的免疫检查点抑制剂⽣物标志物包括PD-L1⾼表达、错配修复基因缺陷（mismatch repair-deficient，dMMR）/微卫星⾼度不稳定性（microsatellite instability-high，MSI-H）和⾼肿瘤突变负荷（tumor mutation burden-high，TMB-H）。PD-L1仅在部分肿瘤适应证中作为使⽤特定药物的临床分⼦标志物，在SARC-028研究
中，PD-L1的表达与PD-1单抗治疗软组织⾁瘤的疗效之间也没有明确的关系[35，37]。dMMR/MSI-H、TMB-H是获得FDA批准、不限组织学类型的免疫治疗⽣物标志物[38-40]，具有此类改变的患者将有可能从免疫治疗中获益。⾻与软组织肿瘤中位TMB偏低（<5 mutations/mb）[41]，但仍有约5%⾁瘤患者具有⾼TMB（TMB≥10 mutations/mb），且分布于多个亚型中[42]。MSI-H在⾁瘤患者中的发⽣频率⾮常低（0.78%）[43]，对⾁瘤免疫治疗的指导意义尚需⼤规模、前瞻性的研究证实。结合临床实际情况，对进展期⾻与软组织肿瘤患者，可采⽤NGS⼤panel（>300基因）检测MSI、TMB等免疫治疗相关的分⼦标志物，部分患者可参考检测结果选择免疫治疗。难以获取即时标本的进展期患者，应慎重选择既往样本的检测结果作为参考。
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2.3 临床试验
共识6：推荐既往治疗失败且⽆有效替代⽅案的⾻与软组织肿瘤患者进⾏NGS检测，以寻找匹配的临床试验机会
⽬前，靶向或免疫治疗在⾻与软组织肿瘤中的应⽤较为有限。除⾻巨细胞瘤、胃肠道间质瘤和炎性肌纤维母细胞瘤等，其余多数肿瘤的靶向或免疫治疗仍处于临床试验阶段。对于⽆标准治疗的进展期⾁瘤患者，可尝试通过NGS检测寻找潜在的药物靶点，靶点阳性但⽆相应药物适应证的患者可能获得参加临床试验的机会。⽬前，正在进⾏临床试验的药物包括MDM2抑制剂（milademetan）、CDK4/6抑制剂（palbociclib、abemaciclib）、mTOR抑制剂（sirolimus）、PARP 抑制剂（olaparib、niraparib、talazoparib）、EZH2抑制剂（tazemetostat）等。随着新的临床试验不断开展，患者可能得到更多的治疗机会。
3. NGS检测样本类型和流程规范
共识7：⾻与软组织肿瘤的NGS样本采集应符合规范要求
NGS分析的样本类型可优选新鲜组织样本，也可选⽤甲醛固定-⽯蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本等[44]。
⼿术和活检的新鲜组织：⼿术采集的组织质量应≥50 mg，穿刺样本≥2条，长度≥0.5 cm。新鲜样本理
想保存⽅式为术后30 min内，迅速置于液氮中保存，或采⽤磷酸盐缓冲溶液或⽣理盐⽔清洗⼲净后，置于-80℃冰箱保存。也可组织离体后30 min内浸⼊⾜量的10%中性福尔马林保存液中固定（组织与浸泡液体⼤⼩⽐例为1∶10），避免使⽤酸性及含有重⾦属离⼦的固定液，72 h内寄送⾄检测实验室。可采⽤冷冻切⽚染⾊评估样本中的肿瘤细胞含量。送检新鲜组织必须确保⾜够病理诊断，应在明确需求下进⾏NGS检测。
glimmerFFPE样本：按病理规范要求取材，NGS检测前应先进⾏苏⽊精-伊红染⾊，评估肿瘤细胞的含量。⼀般情况下，适合NGS检测的组织肿瘤细胞含量应>20%，坏死细胞含量<10%。组织样本量应满⾜NGS检测的基本需求，⼀般⽯蜡切检规格建议厚度5～10 µm，每⽚组织⾯积>5 mm×5 mm，以保证获得⾜够的DNA或RNA，但具体条件可依据不同检测项⽬⽽定。酸脱钙处理过的⽯蜡组织样本不建议进⾏NGS检测，如含⾻组织制备的⽯蜡组织样本。⾻肿瘤的过度酸处理会造成组织和细胞抗原成分的破坏和丢失，影响IHC染⾊效果[45]，同时对核酸总量及完整性造成不同程度的影响[46]。建议该类样本脱钙处理前，采集周围不需要进⾏脱钙处理的疑似肿瘤组织；对需要进⾏脱钙处理的肿瘤组织，可分别采⽤常规脱钙（⽤于常规病理诊断）和⼄⼆胺四⼄酸（EDTA）处理（备⽤分⼦检测）两种⼿段同时进⾏。
样本质量对检测结果和分析⾄关重要，样本运送过程要确保各类样本运送安全、⽆污染、⽆降解[47]。
共识8：⾻与软组织肿瘤的NGS⽣物信息学分析应符合规范要求，配备完善的标准分析及质量控制流程
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NGS数据的⽣物信息分析应包括原始测序数据的质控（如涵盖Q30等FASTQ质量参数），数据过滤及质控（引物序列去除、接头序列去除、低质量序列去除等，重要参考指标包括过滤后数据Q30），序列⽐对及质控（DNA、RNA需分别选⽤合适的⽐对软件和参考基因组，质控指标包括⽐对⾄参考基因组的⽐例等），样本测序质控（DNA应包含panel的覆盖深度、靶向区域覆盖度、插⼊⽚段长度等重要参数，RNA应包含靶向区域测序reads总量等重要参数），以及变异的鉴定分析、注释和筛选。针对不同类型的变异，如DNA层⾯的碱基替换、插⼊/缺失、拷贝数变异、MSI、TMB及RNA层⾯的基因融合、外显⼦跳读等，采⽤特定的⽣物信息学⽅法进⾏分析，并通过适量例数的标准品和临床样本进⾏能⼒验证，应符合国家卫⽣健康委临床检验中⼼的⾼通量测序检验⽣物信息学分析能⼒要求，保证分析流程的准确性和稳定性。送检样本及全部测序和分析报告流程应符合《临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识》《⼆代测序技术在肿瘤精准医学诊疗中的应⽤专家共识》等共识的基本要求[44，47-50]。生活大爆炸3
NGS检测也存在⼀定局限性：1）NGS检测在某些特殊序列区域检出敏感性下降或存在假阳性的可能；2）在DNA层⾯拷贝数变异检出⽔平有限，在RNA层⾯受RNA质量影响较⼤，且扩增法测序容易污染等。此外，临床⼯作中也应特别注意NGS panel的检测范围。
共识9：推荐有美国病理学家协会（CAP）/美国临床实验室改进法案修正案（CLIA）/中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认证或认可的实验室进⾏NGS检测
NGS实验室建设应符合《NGS实验室建设标准与要求》的相关规定，以“⼯作有序、互不⼲扰、防⽌污染、报告及时”为基本原则进⾏实验室分区[44]。NGS检测的实验室建议包括8⼤实验区域，分别为试剂准备区、标本与⽂库制备区、DNA打断区、杂交捕获区（扩增⼀区）、⽂库扩增区（扩增⼆区）、⽂库检测区、测序区、电泳区。实验室应做好分析前（标本采集、运送和保存、处理及病理质控）、分析中（室内质控）、分析后（结果报告解释及临床应⽤）全流程的质量控制。
推荐实验室获得CAP、CLIA或CNAS认证资质。NGS临床实验室应每年参加由病理质控中⼼、国家卫⽣健康委临床检验中⼼、欧洲分⼦基因诊断质量联盟等权威机构组织的基因检测能⼒评估，以证实实验室质量管理体系符合标准。
4. NGS检测报告的临床解读
共识10：倡导各单位组建分⼦肿瘤专家委员会（molecular tumor boards，MTB），依据国内外专家共识及解读流程，正确解读NGS检测结果，制定精准诊疗⽅案
1份标准的肿瘤NGS基因检测报告分为4个部分内容：1）基本信息，包含患者姓名、样本类型、病理
信息、临床信息、检测项⽬和⽇期等；2）基因检测结果，清晰呈现本次检测结果，便于阅读；3）变异注释和临床解读，对变异形式进⾏
