·30·
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有癌症中分别位居第5位和第3位［1］。炎
症和感染导致的DNA损伤积累会增加胃黏膜细胞的基因组不稳定性，进而诱发胃癌［2］。核苷酸切除修复系统 （nucleotide excision repair，NER ） 是一种功能强大的DNA损伤修复系统，在保持胃黏膜细胞基因组的稳定性和完整性方面具有重要作用［3］。DNA 损伤结合蛋白2 （DNA damage -binding protein 2，DDB2） 是一种由DDB2基因编码的分子量为48×103
· 论著 ·
DDB2基因不同转录本在胃癌和正常胃组织中的表达
差异及其对胃癌细胞增殖的影响
郑博文1，2，刘经纬1，2，孙丽萍1，3，邢承忠1，
2
rip是什么梗
（中国医科大学附属第一医院 1. 肛肠外科；2. 肿瘤病因与筛查研究室；3. 辽宁省教育厅消化道肿瘤病因与预防重点实验室，沈阳 110001）
摘要 目的 探讨DDB2基因不同转录本在胃癌和远端正常胃组织中的表达差异及其对胃癌细胞增殖的影响。方法 提取22对胃癌和远端正常胃组织的总RNA，利用实时定量PCR （RT -qPCR ） 检测DDB2基因WT 和D1转录本的表达。构建DDB2基因WT 和D1过表达质粒以及空载体，分别将其转染入胃癌BGC823细胞中。采用Western blotting 检测各组细胞中转染质粒的表达情况、细胞凋亡行为和上皮-间充质转化情况，采用CCK -8实验检测各组细胞的增殖情况。结果 胃癌组织中DDB2基因D1转录本的表达水平显著高于远端正常胃组织 （P < 0.01），而WT 转录本的表达无明显差异。体外实验中，WT 转录本促进BGC823细胞增殖 （P < 0.05），而D1转录本抑制BGC823细胞增殖 （P < 0.01）。2种转录本对胃癌细胞的凋亡行为和上皮-间充质转化现象无明显影响。结论 DDB2基因D1转录本在胃癌组织中表达增强，不同转录本对胃癌细胞的增殖行为产生相反作用。关键词 DDB2基因； WT 转录本； D1转录本； 胃癌
中图分类号 R735.2 文献标志码 A 文章编号 0258-4646 （2021） 01-0030-04网络出版地址 knski/kcms/detail/21.1227.R.20201219.1744.012.html DOI：10.12007/j.issn.0258‐4646.2021.01.006最有前景的专业
Expression of different DDB2 gene transcripts in gastric cancer and normal gastric tissues and their effects on the proliferation of gastric cancer cells
ZHENG Bowen 1，2，LIU Jingwei 1，2，SUN Liping 1，3，XING Chengzhong 1，2
（1. Department of Anorectal Surgery，The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China；2. Tumor Etiology and Screening Department of Cancer Institute and General Surgery，The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China；3. Key Laboratory of GI Cancer Etiology and Prevention in Liaoning Province，The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China ）
Abstract Objective To study the expression of different transcripts of the DDB2 gene in gastric cancer and distal normal gastric tissues，and their effects on the proliferation of gastric cancer cells. Methods Total RNA from 22 pairs of gastric cancer tissues and distal normal gastric tissues was extracted. The expression of DDB2 gene transcripts WT and D1 in the gastric cancer and distal normal gastric tissues were detected by quantitative real -time PCR. WT and D1 overexpression plasmids and empty vector were constructed and transfected into BGC823 cells. Western blotting was ud to detect the expression of the plasmid，apoptosis behavior，and epithelial -menchymal transition. The proliferation of BGC823 cells was detected using the CCK -8 assay. Results
The content of D1 transcript in gastric cancer tissues was significantly higher than that in distal normal gastric tissues （P < 0.01），while no significant difference in the content of WT transcript was found. In vitro，WT transcript promoted the proliferation of BGC823 cells （P < 0.05），while D1 transcript inhibited the proliferation of BGC823 cells （P < 0.01） . There was no significant difference in the effects of the two transcripts on cell apoptosis and epithelial -menchymal transition. Conclusion Enhanced expression of DDB2 D1 transcript was found in gastric cancer tissues. Different transcripts displayed opposite function in the regulation of gastric cancer cell proliferation.Keywords DDB2 gene； WT transcript； D1 transcript； gastric cancer
基金项目：辽宁省自然科学基金 （2019-ZD-0748） 作者简介：郑博文 （1994-），男，硕士研究生.通信作者：邢承忠，E -mail：***************收稿日期：2020-05-18网络出版时间：2020-12-22 8:55
中国医科大学学报 第50卷 第1期 2021年1月
Journal of China Medical University Vol.50 No.1 Jan. 2021
·
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的蛋白质，在NER修复通路中，它参与构成的DDB复合物能够识别DNA损伤部位，进而启动NER过程并完成损伤修复［4］。近期研究［5］表明，DDB2亦可通过NER通路之外的途径影响结直肠癌等多种癌症的发生和发展，其在调控肿瘤细胞生物学行为方面具有重要作用。
选择性剪切是将基因或mRNA前体转录产生的RNA外显子以多种方式剪切重连并产生多种不同长度mRNA的过程，这些不同长度的mRNA亦被称为剪接变异体［6］。选择性剪切是基因表达调控的关键步骤，通过选择在特定时间和特定细胞中产生剪接变异体，能够增加细胞的转录多样性；失调的选择性剪切经常出现在人类肿瘤中，并通过多种途径调控癌症的进程［7］。因此，阐明重要基因的不同剪接变异体在胃癌发生、进展中的功能和调控至关重要。检索NCBI数据库的子数据库Nucleotide可知，DDB2基因有2个已被证实的剪接变异体WT和D1。DDB2基因的野生型转录本WT含有10个外显子，全长1 870 bp，编码含427个氨基酸的蛋白；而变异型转录本D1长度较短，N端和C端与常见转录本相同，但缺少4个外显子 （外显子4、5、6、7），全长717 bp，编码含238个氨基酸的蛋白。此外有研究［8］指出，DDB2基因rs830083多态突变型GG基因型显著提高了胃癌的发病风险，而rs830083正好位于D1转录本缺失的第4外显子附近，提示rs830083多态突变型GG基因型可能参与调控D1转录本的表达，进而影响胃癌的发生。目前的研究表明，DDB2基因D1转录本在胃癌中可能具有重要作用，且DDB2基因的2种转录本在胃癌中的表达水平与功能尚不明确。因此，本研究通过实时
定量PCR （quantitative real-time PCR，RT-qPCR） 、CCK-8、Western blotting等方法，深入探讨DDB2基因的2种剪接变异体在胃癌细胞中表达水平的差异及其对胃癌细胞生物学行为的影响。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象：选择于中国医科大学附属第一医院肛肠外科接受胃癌手术的患者22例，其中男15例，女7例，平均年龄59.2岁。术后30 min内留取胃癌癌灶和远端正常胃组织，-80 ℃冻存待用。全部病例均经病理组织学检查确诊。本研究获得中国医科大
学附属第一医院伦理委员会批准。幼儿英语教材
1.1.2 细胞株：胃癌细胞株BGC823，来自中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所第三研究室细胞库。
1.2 方法
1.2.1 组织RNA提取、反转录及RT-qPCR检测：采用RNAiso Plus （日本TaKaRa公司） 提取22对胃癌组织和远端正常胃组织的总RNA，然后用RT Master Mix （日本TaKaRa公司） 将其
反转为cDNA，最后将cDNA 和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ （日本TaKaRa公司） 适量比例混合，以完成qPCR。根据PCR所得的△Ct值，计算标准化的2-△△Ct。DDB2基因WT转录本引物：上游5’-CCAACCAGTTTTACGCCTCCTC-3’，下游5’-TGTCTCCTGTGACCACCATTCG-3’；DDB2基因D1转录本引物：上游，5’-CACCTTCATCAAAGGGGCAG-3’，下游5’-GAACACGTCGATCGTCCTCA-3’；GAPDH 基因引物：上游5’-TCTTCCAGGAGCGAGATCCCT-3’，下游5’-GCAAATGAGCCCCAGCCTTCT-3’。
1.2.2 质粒的构建和转染：分别构建DDB2基因WT、D1转录本的过表达质粒和空载体 （上海吉凯基因医学科技股份有限公司）。用含10%胎牛血清的1640培养基在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中，用6孔板培养胃癌BGC823细胞。待BGC823细胞生长至60%~80%时，按照转染说明书分别将1 μg质粒与2 μL转染试剂在200 μL缓冲液中混合，混匀后静置10 min，将混合液其加入到细胞中，4 h后换液。根据所加质粒不同，将BGC823细胞分为空载体组、WT组和D1组，以进行后续实验。
1.2.3 Western blotting：收集各组BGC823细胞，在100 μL RIPA （上海索莱宝生物科技有限公司） 中裂解并提取细胞总蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒 （上海索莱宝生物科技有限公司） 测定蛋白浓度并配平。加入5×loading buffer煮沸5 min。之后使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，每孔加入蛋白30 μg，浓缩胶70 V 30 min，分离胶110 V 90 min。切下待用的凝胶后用三明治法湿转120 min，将蛋白转印于PVDF膜上。用10%脱脂牛奶室温封闭1 h。PBST清洗后孵育
一抗 （Flag抗体，日本GNI公司；GAPDH抗体，德国Bioworld公司；PARP抗体，美国Cell Signaling Technology公司；E-Cadherin抗体，美国Abcam公司），4 ℃ 过夜；PBST清洗后室温孵育二抗 （兔二抗，美国Abcam公司） 2 h，PBST清洗后用发光液 （上海碧云
第1期 郑博文等. DDB2基因不同转录本在胃癌和正常胃组织中的表达差异及其对胃癌细胞增殖的影响
·32·天生物技术有限公司） 发光，显影后保存图片，观察Flag蛋白、PARP蛋白和E -cadherin蛋白的表达水平，以检测各组细胞的转染、凋亡和上皮-间充质转化 （epithelial -menchymal transition，EMT ） 情况。1.2.4 CCK -8增殖实验：在各组BGC823细胞状态稳定后，用胰酶将细胞消化下来并计数。将细胞悬液浓度调整至3×104/mL，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液。提取剩余细胞的总蛋白，通过Western blotting检测质粒上的3*Flag来检测各组的转染情况。分别在24、48和72 h后，向每孔加入10 μL CCK -8试剂 （美国MCE公司），2 h后检测其在450 nm处的光密度 （optical density，OD ） 值并进行比较。实验重复3次。
1.3 统计学分析
应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资
深圳英语料以x -±s 表示，2组比较采用t 检验。采用GraphPad
Prism 7制作柱状图。P < 0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 DDB2基因WT、D1转录本在胃癌和远端正常胃组织中的RNA表达水平
通过RT -qPCR检测22对胃癌组织及其对应的远端正常胃组织中DDB2基因WT、D1转录本的RNA表达水平。RT -qPCR结果显示：胃癌中DDB2基因D1转录本的RNA表达水平显著高于远端正常胃组织 （P < 0.01），而WT转录本在胃癌和远端正常胃组织中的RNA表达水平无统计学差异。见表1。
2.2 DDB2基因WT、D1转录本对胃癌细胞增殖能力
表1 胃癌和远端正常胃组织中WT和D1转录本RNA表达水平的差异
Tab.1 Content of WT and D1 transcripts in gastric cancer and corresponding normal gastric tissues Splice variant n △Ct 2-△△Ct P WT
0.792
Normal gastric tissue 22 6.32±1.37 1.00 Gastric cancer tissue 22
6.31±1.55
1.01
D1
0.004
Normal gastric tissue 2213.14±2.00 1.00 Gastric cancer tissue
22
12.00±1.69
2.20
的影响
Western blotting结果显示：空载体组、WT组和D1组质粒均成功转染入BGC823细胞中。CCK -8实验发现，培养48和72 h后，WT组的OD值大于空载组 （P < 0.05），而D1组的OD值小于空载组 （P < 0.01）。表明DDB2基因WT转录本促进胃癌细胞增殖，而D1转录本抑制胃癌细胞增殖。见图1、图2。
2.3 DDB2基因WT、D1转录本对胃癌细胞的凋亡行
为和EMT现象的影响
Western blotting结果显示：各组细胞中E -cadherin 蛋白和PARP水解产物的表达量无明显差异，提示
DDB2基因WT、D1转录本对胃癌细胞的凋亡行为和EMT现象无明显影响。见图3。3 讨论
NCBI在线数据库显示，DDB2基因有WT、D1两种转录本。QIAO等［9］发现，在胃癌中DDB2基因WT 转录本编码的DDB2野生型蛋白可以抑制PAQR3的泛素化进程，但并未提及其在胃癌和远端正常胃组织中表达量的差异，其表达量情况与本研究相符。
DDB2基因的D1转录本与WT转录本相比缺少4个外显子，其编码蛋白发挥的功能可能有较大差异。RT -qPCR结果显示，D1转录本的RNA表达水平在胃癌和远端正常胃组织中有统计学差异 （P < 0.01），这使
1，empty vector group；2，WT group；3，D1 group.
图1 BGC823细胞质粒转染情况Fig.1 Plasmid transfection of BGC823 cells
1
2
3
Flag
GAPDH
阿房宫赋翻译63×103
48×10335×10348×10
3
35×103
中国医科大学学报 第50卷
·33·
得D1转录本有可能成为胃癌的筛查标志物，其具体应用仍需后续实验加以探索。
本研究中，CCK -8结果显示，与转染了空载质粒的BGC823细胞相比，转染WT转录本质粒的BGC823细胞增殖效应增强 （P < 0.05），与QIAO等［9］的结果相符；而转染D1质粒的BGC823细胞增殖效应减弱 （P < 0.01）。这种同一基因的不同转录本发挥不同功能的现象并非个例。检索PubMed数据库可知，其他基因如TERF1等［10］的剪接变异体可以影响癌细胞的生物学功能，甚至其多种转录本发挥的作用完全相反。结合RT -qPCR结果大胆推测：DDB2基因D1转录本可能在胃癌中发挥抑癌作用，在检测到细胞癌变倾向后D1转录本大量转录以抑制胃细胞癌变，并在胃细胞癌变不可逆之后仍然保持高转录效率，起到抑制胃癌细胞生长的作用。
凋亡是细胞重要的生物学行为之一，本研究通
过Western blotting检测胃癌细胞中PARP水解产物的蛋白表达量，判断DDB2基因的2种转录本对细
胞凋亡的影响。有研究［11］表明，DDB2基因WT转录本编码蛋白可以识别DNA损伤，并通过NER通路修复损伤；若DNA损伤积累过多，则WT转录本蛋白可下调P21蛋白并促进细胞凋亡。但是本研究在胃癌细胞中并未发现相似结论。结合本研究结果进行推断，
DDB2基因WT编码的野生型蛋白主要负责DNA损伤的识别，仅能根据DNA损伤的程度决定是修复损伤还是促使细胞凋亡［12］；其本身的表达量对细胞凋亡的进程可能影响不大。ROY等［13］发现，DDB2可以抑制VEGF 、Snail 和Zeb1基因的表达，进而抑制结肠癌细胞的EMT现象，但是本研究并未发现DDB2基因WT转录本对胃癌细胞的EMT现象产生影响。虽然胃癌与结肠癌均为消化道肿瘤，但是胃癌细胞与结肠癌细胞在形态、功能、蛋白组成方面均有较大差异。正是因为这些差异，DDB2在两者中发挥的作用可能并不相同，其具体原因仍需后续实验加以论证。
综上所述，本研究检测了DDB2基因的2种转录本在胃癌组织和远端正常胃组织中的RNA表达水平，并发现D1转录本在胃癌中高表达，而WT转录本在2种组织中的RNA表达水平并无明显差异。而后在体外实验中发现，DDB2基因WT转录本促进胃癌细胞增殖，而D1转录本抑制胃癌细胞增殖。目前
DDB2基因的2种转录本在胃癌中的作用机制尚不明确，仍需后续实验加以探索。通过对胃癌中DDB2基
* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001.
图2 WT、D1转录本对BGC823细胞增殖能力的影响
Fig.2 Effects of WT and D1 transcripts on the proliferation of BGC823 cells
1.51.0
0.5
0.0
24 h 48 h
72 h
*
*
*
**
**
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D 1
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D 1
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1，empty vector group；2，WT group；3，D1 group.
图3 BGC823细胞中E -cadherin与PARP水解产物的表达量Fig.3 Expression of E -cadherin and PARP hydrolysate in BGC823
cells
1
2 3
E -cadherin
PARP
GAPDH
（下转第39页）
第1期 郑博文等. DDB2基因不同转录本在胃癌和正常胃组织中的表达差异及其对胃癌细胞增殖的影响
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（编辑 陈 姜）
因WT、D1转录本的深入研究，可以进一步解释胃癌的发生、发展机制，有利于发现更好的胃癌治疗手段。
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（编辑 陈 姜）
（上接第33页）
第1期 邢泽等. 拮抗剂方案中应用GnRHa扳机与hCG扳机对妊娠结局的影响
