植 物 分 类 学 报 45 (6): 828–840(2007) doi:10.1360/aps07001
Acta Phytotaxonomica Sinica
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2007-01-04收稿, 2007-04-16收修改稿。
cablemodem基金项目: 国家自然科学基金(40476053; 30670156)资助(Supported by the National Natural Science Foundation of China,
Grant Nos. 40476053, 30670156)。
* 通讯作者(Author for correspondence. E-mail: )。
中国沿海甲藻两个新记录属——
艉杆藻属和易碎藻属
1, 2
顾海峰* 3王 艳 1
(中国海洋大学海洋生命学院 青岛 266003) 2(国家海洋局第三海洋研究所海洋地质和环境开放实验室 厦门 361005)
3(暨南大学理工学院环境工程系 广州 510632)
The first record of Ensiculifera Balech and Fragilidium新东方六级高频词汇
Balech (Dinophyceae) from Chine coast
1, 2
GU Hai-Feng * 3WANG Yan 1
juniorschool
(College of Marine Biology, Ocean University of China , Qingdao 266003, China) 2
(Department of Geology and Environment, Third Institute of Oceanography , Xiamen 361005, China) 3(Department of Environmental Engineering, College of Science & Engineering, Jinan University , Guangzhou 510632, China)
Abstract Resting cysts and vegetative cells of Ensiculifera Balech and Fragilidium Balech
have never been reported in China Sea. Such kinds of cysts were collected in the East China Sea and were allowed to germinate. The cyst of Ensiculifera sp. is spherical with a diameter
of 22 µm. The cyst consists of two layers and is full of greenish granules, with a bright red
university of washington
body inside. The cyst wall is covered with short organic spines (2 µm long). The cell of
Ensiculifera sp. compris a conical epitheca and a rounded hypotheca, with the dimension of
17.7 µm long and 12.5 µm wide on the average. The plate pattern is po, x, 4′, 3a, 7′′, 5c, 4s, 5′′′, 2′′′′. The cysts of Fragilidium mexicanum Balech are spherical with the diameter ranging
from 54–60 µm. They are full of pale white granules and brown protoplasm, with a bright
yellow body prent. The archeopyle is spherical. The cells of F . mexicanum are 45.3 µm long
and 42.8 µm wide, with the plate formula of po, 5′, 7′′, 10c, 7s, 7′′′, 2′′′′, 1P. The cyst of
Fragilidium sp. is also spherical with a diameter of 45 µm, which is similar to that of F .
mexicanum except that the yellow body is not prent. The cells of Fragilidium sp. are 41.6
µm long and 35.3 µm wide with the plate formula of po, 5′, 7′′, 7′′′, 2′′′′, 1P. The Internal
Transcribed Spacers (ITS) of Ensiculifera sp. and the small subunit (18S) rDNA of
Fragilidium spp . were amplified and quenced. Their phylogenetic positions agree with the
morphological taxonomy.
Key words Ensiculifera , Fragilidium , Fragilidium mexicanum , dinoflagellate, cyst, China
Sea.
摘要 艉杆藻属Ensiculifera Balech 和易碎藻属Fragilidium Balech 的营养细胞和孢囊在中国沿海还未被
记录过, 作者在中国东海发现了它们的孢囊并通过萌发建立了株系, 在光镜和电镜下研究了其细胞形
态。一种艉杆藻的孢囊为圆形, 直径22 µm, 双层壁, 孢囊体内充满淡绿色的颗粒, 有一个鲜艳的红色
体, 孢囊外壁覆盖着2 µm 长的有机质短刺; 营养细胞上壳圆锥形, 下壳圆形, 细胞平均长17.7 µm, 宽
12.5 µm, 甲板方程式为po, x, 4′, 3a, 7′′, 5c, 4s, 5′′′, 2′′′′。墨西哥易碎藻Fragilidium mexicanum Balech 的孢
囊为圆形, 直径54–60 µm, 孢囊内充满淡白色的颗粒物以及淡褐色的原生质体, 有一个鲜艳的黄色体,
萌发孔圆形, 偏在孢囊的一侧; 营养细胞平均长45.3 µm, 宽42.8 µm, 甲板方程式po, 5′ , 7′′, 10c, 7s, 7′′′,
6期顾海峰, 王艳: 中国沿海甲藻两个新记录属——艉杆藻属和易碎藻属829
2′′′′, 1P。一种易碎藻的孢囊为圆形, 直径45 µm, 孢囊内充满淡白色的颗粒物以及淡褐色的原生质体, 黄色体不明显, 细胞壁较厚, 2–3 µm, 无色, 萌发孔圆形, 偏在孢囊的一侧。细胞平均长41.6 µm, 宽35.3 µm, 甲板方程式po, 5′ , 7′′, 7′′′, 2′′′′, 1P。对该种艉杆藻的转录间隔区(ITS)、2种易碎藻的小亚基(18S)序列进行了测定并建立了系统发育树, 它们的系统发育位置和形态学分类相吻合。
关键词艉杆藻属; 易碎藻属; 墨西哥易碎藻; 甲藻; 孢囊; 中国沿海
很多甲藻在其生活史的某个阶段以休眠孢囊的形式存在, 其比例大约是甲藻总数的10%。绝大多数甲藻都是单倍体, 在某些环境因子的诱导下, 细胞会转化成配子, 两个配子结合后形成二倍体的合子, 合子可以直接进行减数分裂回到单倍体的细胞(Figueroa & Bravo, 2005), 但多数情况下它们会形成休眠孢囊(resting cyst), 并沉降到沉积物中。孢囊需要度过长度不等的休眠期, 在此期间无论条件如何它们都
不会萌发。只有在度过了休眠期后, 并具备适宜的环境条件(通常为光照、氧气和合适的温度)(Anderson et al., 1987)孢囊才会萌发, 并通过减数分裂回到单倍体的细胞。甲藻孢囊可以在海底存活数十年, 因此沉积物中的孢囊反映了过去几年水体中甲藻出现的记录。甲藻孢囊根据细胞壁的组成可以分成两类, 第一类具有和孢粉类似的有机质细胞壁, 称为有机质孢囊; 第二类具有碳酸钙结晶形成的细胞壁, 称为钙质孢囊。产生钙质孢囊的种类都被划分在钙甲藻亚科Calciodinellaceae下, 该亚科包括斯氏藻属Scrippsiella Balech ex Loeblich III和艉杆藻属Ensiculifera Balech以及一些根据孢囊定义的属(比如Calcigonellum Deflandre、Calciodinellum Deflandre等)(Fensome et al., 1993; Montresor et al., 1997; Meier et al., 2002)。钙甲藻亚科下也有一些种类产生有机质的而不是钙质的孢囊(如汉高斯氏藻Scrippsiella hangoei (Schiller) Larn、伊玛艉杆藻Ensiculifera imariensis Kobayashi & Matsuoka)。我们发现了艉杆藻属产生的一个有机质孢囊, 并根据萌发获得的细胞形态进行了验证。易碎藻属Fragilidium Balech属于Helgolandinioideae亚科(Fensome et al., 1993), 就像其名字暗示的那样, 该类甲藻的甲板脱落后很容易断裂。易碎藻属和艉杆藻属下已经描述的种类都只有5种, 它们的细胞分布情况很少报道, 可能与细胞较小或固定后容易破碎有关, 但是易碎藻属的孢囊却在很多海域被发现(Owen & Norris, 1985; Blanco, 1989; Sonneman & Hill, 1997; Orlova et al., 2004)。
易碎藻属和艉杆藻属的营养细胞至今在中国沿海水体中未被记录, 此前在东海甲藻孢囊的研究中也没有被报道(Qi et al., 1996; Cho & Matsuoka, 2001; 王朝晖, 齐雨藻, 2003; 顾海峰等, 2004), 我们通过萌
发试验得到了多株细胞, 对其甲板进行了观察, 并测定了其分子序列, 系统发育结果和形态学分类相吻合, 本研究的结果有助于全面了解中国海区的甲藻多样性。
借东西的小人阿莉埃蒂电影1材料和方法
1.1样品的采集和处理
样品在2002年11月和2005年3月采集于东海的两个站位(122°30.64′ E, 29°0.01′ N; 121°25.54′ E, 27°12.46′ N), 取表层沉积物, 在4 ℃条件下保存。称量5 g样品与灭菌海水混匀, 超声波处理2 min (100 W), 100和15 µm筛绢过滤, 取留在15 µm 筛绢上的样品在
830
植物分类学报45卷Olympus显微镜下对孢囊进行鉴定(100×)。另外用微细玻璃管分离活体孢囊到装有不加硅的f/2培养液(Guillard & Ryther, 1962)的96孔细胞培养板进行孵化(20 ℃, 3000 lx, 12 h 光: 12 h黑暗)。
1.2 藻细胞的形态观察
萌发所得的藻类细胞用2%甲醛固定、calcofluor染色(Fritz & Triemer, 1985), 在Olympus (BX51, 东京,
日本)荧光显微镜下观察甲板组成。离心收集指数期的细胞, 用终浓度2%的戊二醛固定。细胞在系列酒精中脱水, 临界点干燥, 喷金, 在Leo1530扫描电子显微镜下观察和照相。
1.3 DNA提取、PCR扩增和测序
离心收集100 mL细胞, 用UNIQ柱式植物基因组提取试剂盒(上海生工)提取DNA;
5.8S和转录间隔区(ITS1、ITS2)用引物ITS1和ITS4 (White et al., 1990)扩增。18S rDNA用一对真核生物通用引物5'-CGAATTCAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'和5'-CCGGAT- CCTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'扩增。PCR反应体积为50 μL, 包括5 U Taq (Takara), 250 μmol/L dNTP, 1×PCR buffer, 2 mmol/L MgCl2, 100 pmol引物, 以及1–10 ng 模板DNA。PCR程序为: 94 ℃变性4 min, 然后开始25次循环，即94 ℃变性1 min, 50 ℃退火2 min, 72 ℃延伸3 min, 最后72 ℃延伸7 min。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳, 1% EB染色, 紫外光下检测。PCR产物直接送上海生工测序。
1.4系统发育分析
序列用 CLUSTAL X程序(Thompson et al., 1997)进行多重比对。系统发育利用MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004)进行最大简约法(Maximum parsimony)分析。
2结果
fall to pieces
2.1形态学
2.1.1 一种艉杆藻(SSND22)孢囊形态: 孢囊圆形, 直径22 µm, 双层壁, 孢囊体内充满淡绿色的颗粒, 一个鲜艳的红色体清晰可见。孢囊外壁密密地覆盖着2 µm长的圆柱形短刺, 刺的远端封闭(图1), 萌发孔不清楚。我们仅发现了该种的一个孢囊。在培养条件下——————————————————————————————————————
aabc
→图1–8艉杆藻的细胞和孢囊(图4、6是电镜照片, 其余均为光镜照片) 1.沉积物中的空壳孢囊, 示有机质的刺。2.培养物中的活体孢囊。3.细胞甲板, 侧面观。4.细胞甲板, 腹面观。5，6.细胞甲板，背面观。7. 细胞下鞘甲板, 示过渡板上的刺(箭头)。8.细胞下鞘甲板, 示纵沟板。图9–17墨西哥易碎藻的细胞和孢囊(图12是电镜照片, 其余均为光镜照片) 9. 沉积物中的活体孢囊, 示黄色体。10. 空壳孢囊, 示萌发孔(箭头)。11. 活体细胞, 示细胞核(箭头)。
12.活体细胞, 示表面结构。13.细胞甲板, 侧面观。14. 细胞甲板, 顶面观。15. 细胞甲板, 腹面观, 示第一沟前板及腹孔(箭头)。16. 细胞甲板, 示纵沟板。17. 细胞甲板, 底面观。图18–20易碎藻的细胞和孢囊(光镜) 18. 培养物中的活体孢囊。19. 培养物中的空壳孢囊。20. 三个不同大小的细胞。
Figs. 1–8.The cell and cyst of Ensiculifera sp. (Figs. 4, 6 are SEM and others are LM). 1. An empty cyst from the field, showing the organic spines. 2. A living cyst in culture. 3. Thecal plates, lateral view. 4. Thecal plates, ventral view. 5, 6. Thecal plates, dorsal view. 7. Hypotheca, showing the spine of t plate (arrow). 8. Hypotheca, showing the sulcal plates. Figs. 9–17.The cell and cyst of Fragilidium mexicanum (Fig. 12 is SEM and others are LM). 9. A living cyst from the field showing the yellow accumulation body. 10. An empty resting cyst showing the archeopyle (arrow). 11. A vegetative cell showing the nucleus (arrow). 12. A motile cell showing the surface of theca. 13. Thecal plates, lateral view. 14. Thecal plates, apical view. 15. Thecal plates, ventral view showing the first precingular plate and the ventral pore (arrow). 16. Sulcal plates. 17. Thecal plates, antapical view. Figs. 18–20.The cell and cyst of Fragilidium sp. (LM). 18. A living cyst of Fragilidium sp. in culture. 19. An empty cyst of Fragilidium sp. in culture. 20. Three cells of different sizes.
Scale bar=5µm.
6期顾海峰, 王艳: 中国沿海甲藻两个新记录属——艉杆藻属和易碎藻属831
该种形成表面光滑的孢囊(图2)。营养细胞形态: 营养细胞上壳圆锥形, 下壳圆形, 比上壳短。细胞长15–22.5 µm (平均17.7 µm, n=17), 宽10–15 µm (平均12.5 µm, n=17)。甲板方程式为po, x, 4′, 3a, 7′′,
5c, 4s, 5′′′, 2′′′′。细胞核圆形, 位于细胞中央。顶孔复合体有一个圆形的顶孔, 向上略微延伸形成一个不明显的顶角(apical horn), 顶孔和1′通过一个长长的导
melissa mccarthy
832
植物分类学报45卷沟板(canal plate)相连(图3)。1′菱形, 较窄, 左右对称(图4)。细胞背面有三块前间插板, 第一和第三前间插板(1a, 3a)都是五边形, 第二前间插板(2a)为六边形, 2a比1a和3a要大(图5, 6)。横沟略微下陷, 左旋, 偏移距离约为横沟高的一半, 第一横沟板和纵沟前板相接处有一根长度和横沟高度相近的刺(图7)。横沟板5块, 第一横沟板很窄, 可以认为是过渡板(t)。纵沟板5块, 包括纵沟前板(sa)、左纵沟板(sl)、右纵沟板(sr)、纵沟间板(sm)和后纵沟板(sp)。sm很小, 位于sl、sr和sp中间。sp和t板没有直接接触(图8)。
2.1.2 墨西哥易碎藻孢囊形态: 孢囊圆形, 直径54–60 µm, 孢囊外壁有一圈很厚的胶质物, 孢囊内充满淡白色的颗粒物以及淡褐色的原生质体, 有一个鲜艳的黄色体清晰可见(图9), 细胞壁很厚, 3–4 µm, 无色, 壁上有颗粒性物质, 萌发孔大, 圆形, 偏在孢囊的一侧(图10)。这种类型的孢囊是东海的常见种, 最大密度达到7.4个/g, 我们总共萌发了5个类似的孢囊, 均得到同一种细胞。营养细胞形态: 细胞一般单个生活, 但有时会排列成链状, 可能是刚刚分裂完毕的2个子细胞。上壳呈圆锥形, 下壳半圆形, 左右不对称, 比上壳长。细胞核长而粗, 位于细胞中央(图11)。细胞长32–57 µm, 宽30–55 µm (平均长45.3 µm, 宽42.8 µm, n=12), 甲板很薄, 在电镜下可见上面密布着小孔(图12)。甲板方程式为po, 5′ , 7′′, 10c, 8s, 7′′′, 2′′′′, 1P。顶孔复合体由一块三角形的甲板和一个耳朵状的顶孔组成(图13, 14), 1′六边形, 较其他顶板要小, 2′五边形, 3′六边形, 比2′略大一点, 4′七边形, 是所有顶板中最大的一块; 1′′四边形, 和顶孔复合体通过两条垂直的线连接, 是所有沟前板中最小的, 板的下方伸出一条平行于横沟的裂缝, 末端膨胀成一
个圆孔(图15)。横沟略微下陷, 左旋, 偏移距离和横沟的高度相当。纵沟板7块, 分别是纵沟前板(sa), 右纵沟前板(sda), 左纵沟前板(ssa), 中间纵沟前板(sma), 左纵沟后板(ssp), 右纵沟后板(sdp), 纵沟后板(sp)(图16)。1′′′和7′′′都是五边形, 它们比其他的沟后板要小很多。1′′′′和2′′′′均为五边形, 但形态和大小都不同, 1P板很大, 约等于1′′′′和2′′′′的面积之和(图17)。
2.1.3 一种易碎藻(G02)孢囊形态: 孢囊圆形, 直径45 µm, 孢囊外壁无胶质物, 孢囊内充满淡白色的颗粒物以及淡褐色的原生质体, 没有黄色体(图18), 细胞壁较厚, 2–3 µm, 无色, 萌发孔在孢囊的一侧, 圆形(图19)。该种孢囊密度较小, 仅成功萌发了一个。营养细胞形态: 细胞上壳呈圆锥形, 下壳半圆形(图20), 细胞核长而粗, 位于细胞中央, 细胞长25–52 µm, 宽22–48 µm (平均长41.6 µm, 宽35.3 µm, n=10)。甲板方程式为po, 5′ , 7′′, 7′′′, 2′′′′, 1P。顶孔复合体由一块三角形的甲板和一个耳朵状的顶孔组成, 1′七边形, 2′五边形, 3′和4′均为六边形。1′′五边形, 远远小于其他的沟前板, 和顶孔复合体通过一条直线连接, 板的下方伸出一条平行于横沟的裂缝, 末端膨胀成一个圆孔; 横沟略微下陷, 左旋, 偏移距离和横沟的高度相当。1′′′′和2′′′′均为五边形, 但形态和大小都有差别。1P 板很大, 约等于1′′′′和2′′′′的面积之和。该种细胞的甲板很薄, 难以得到清晰的照片。
2.2 系统发育分析
对1株艉杆藻(SSND22)进行了转录间隔区(ITS)序列的测定, 这是因为钙甲藻亚科在基因库中有丰富的
该片段的序列, 而其他的片段, 比如小亚基(18S), 可得到的数量很少。结果表明艉杆藻的ITS1长197 bp, ITS2长201 bp, 它和伊玛艉杆藻(D207)的相似性为84.21%, 但是和代尔五隔藻Pentapharsodinium dalei Indelicato & Loeblich的相似性却达
6期顾海峰, 王艳: 中国沿海甲藻两个新记录属——艉杆藻属和易碎藻属833 表1 系统发育分析所用到的种类、株系、基因号和参考文献
Table 1 Species name, strains, their GenBank accession number and reference in the phylogenetic analysis
种类Taxon 株系
Strain
基因号
GenBank No.
参考文献
Reference
Calciodinellum albatrosianum (Kamptner) Janofske &怎么讲好普通话
Karwath
M34-17 AY676144 Gottschling et al., 2005b
C. levantinum Meier, Janofske & Willems GeoB122 AY676146 Gottschling et al., 2005b
C. operosum Deflandre SZN74 AY327462 Gottschling & Plotner, 2004 Calcigonellum infula Deflandre SZN62 AF167387-88 D’Onofrio et al., 1999 Ensiculifera cf. imariensis Kobayashi & Matsuoka JB3 AF167379-80 D’Onofrio et al., 1999
E. aff. imariensis Kobayashi & Matsuoka D207 AY728076 Gottschling et al., 2005a
E. loeblichii Cox & Arnott UTEX LB1595AF167373-74 D’Onofrio et al., 1999
E. aff. loeblichii Cox & Arnott GeoB220 AY499513 Gottschling et al., 2005a Ensiculifera sp.SSND22 this
study Pentapharsodinium tyrrhenicum (Balech) Montresor,
Zingone & Marino
SZN13 AF167375-76 D’Onofrio et al., 1999
P. tyrrhenicum GeoB229 AY499512 Gottschling et al., 2005a
P. dalei Indelicato & Loeblich III SZN19 AF527817 Montresor,M. et al., 2003 Scrippsiella hangoei (Schiller) Larn SHTV1 AY499515 Gottschling et al., 2005a
S. lachrymosa Lewis SZN75 AF167389 D’Onofrio et al., 1999
S. lachrymosa IO25-01 AY676150 Gottschling et al., 2005a
S. precaria Montresor & Zingone CS-294 AY499518 Gottschling et al., 2005a
S. ramonii Montresor SZN7 AF167381 D’Onofrio et al., 1999
S. rotunda Lewis SSND11 this study, with the same
小学英语教学论文quence as AF167385
S. rotunda GeoB280 AY788355 Gottschling et al., 2005b
S. rotunda SZN66 AF167385 D’Onofrio et al., 1999
S. sweeneyae Balech ex Loeblich III CCCM 280 AY499528 Gottschling et al., 2005a
S. sweeneyae NIES684 AY499520 Gottschling et al., 2005a
S. trifida Lewis GeoB109 AY499521 Gottschling et al., 2005a
S. trochoidea (Stein) Loeblich III GeoB140 AY676152 Gottschling et al., 2005b
S. trochoidea GeoB188 AY499524 Gottschling et al., 2005a
S. trochoidea GeoB201 AY676158 Gottschling et al., 2005b
S. trochoidea GeoB210 AY676159 Gottschling et al., 2005b
S. trochoidea GeoB214 AY676160 Gottschling et al., 2005b
S. trochoidea GeoB251 AY788358 Gottschling et al., 2005b
S. trochoidea SZN77 AF527096 Montresor et al., 2003
S. trochoidea SZN90 AF527109 Montresor et al., 2003
S. trochoidea var. aciculifera Montresor GeoB160 AY499526 Gottschling et al., 2005a
S. trochoidea var. aciculifera SCCAP499 AF527066 Montresor M. et al., 2003
S. trochoidea var. aciculifera SZN60 AF167391 D’Onofrio et al., 1999
到了88.47%。对该株艉杆藻以及来自基因库中的序列(表1)进行了最大简约法分析, 建立了系统发育树, 2株伊玛艉杆藻和本株艉杆藻聚合在一起, 支持度达到89%, 代尔五隔藻是距离它们最近的一个种, 支持度为85%, 特里五隔藻Pentapharsodinium tyrrhenicum (Balech) Montresor, Zingone & Marino和它们共同组成了一个类群, 支持度为84%, 艉杆藻属的另一个种——Ensiculifera loeblichii Cox & Arnott, 是距离这个类群最近的。斯氏藻属、Calcigonellum和Calciodinellum的种类组成了另一个类群, 支持度达到99%。这两个类群互为姐妹组, 支持度达到100% (图21)。
