免疫磁捕获-实时荧光PCR 快速检测鸡肉中沙门氏菌
*
张东方1，2，袁飞1，王娉1，胡玥1，陈颖1，葛毅强
专业化妆培训2，3
1（中国检验检疫科学研究院，北京，100123）2（中国农业大学食品学院，北京，
100083）3（中国农村技术开发中心，北京，
100045）摘
要
对免疫磁捕获-实时荧光PCR 检测鸡肉中沙门氏菌进行了初步研究。主要包括免疫磁珠制备条件的选
择及优化，
通过实验最终确定了以6mg /mL EDC 和5mg /mL NHS 活化直径为700nm 的羧基聚苯乙烯磁性微球，与浓度为100μg /mL 的沙门氏菌抗体在37ħ振荡孵育1.5h ，制备得到抗沙门氏菌免疫磁珠，与市售沙门氏
菌免疫磁珠试剂盒（Dynal 产品）捕获效率相当。免疫磁捕获-实时荧光PCR 检测方法检测限为104
CFU /mL 左右，能在16h 内检测出鸡肉中104
CFU /mL 的沙门氏菌，可用于食品中沙门氏菌的快速检测。
关键词沙门氏菌，免疫磁捕获法，实时荧光PCR ，检测
第一作者：硕士研究生（陈颖研究员，葛毅强教授为通讯作者）。
*国家科技支撑计划项目（2009BAD9B06）；国家质检总局科研计划项目（2009IK312、
2010IK178）。收稿日期：2011－02－28
沙门氏菌属（Salmonella spp.）常存在于肉制品、
蛋、奶类等畜禽产品中，是最常见的人畜共患的病原菌之一，根据国际食源性病原菌所致危害的严重
性，沙门氏菌被列为首选控制的食源性致病菌
［1］
。目前
沙门氏菌的检验多采用传统的检测方法、
PCR 方法及实时荧光PCR 法等。传统的检测方法一般需要5 7d ，周期长，过程繁琐；PCR 方法及实时荧光PCR 方法，虽然操作简单，但需要待检样品中菌体达到较高浓度。免疫磁珠（Immunomagnetic Beads ，
IMB ）具有选择性好，
特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制PCR 扩增的成分。已有学者利用免疫磁珠结合传统显色培养法、
酶联免疫或普通PCR 等方法进行沙门氏菌检测，仍存在耗时长，操作复杂等问题
［2－3］
。
本
研究优化了沙门氏菌免疫磁珠制备条件，
建立了沙门氏菌免疫磁捕获-实时荧光PCR 快速检测方法，利用该方法检测了人工污染沙门氏菌鸡肉样品，并对比了
自制免疫磁珠与免疫磁珠试剂盒的捕获效率。
1
材料与方法
1.1
实验材料1.1.1
实验菌株
沙门氏菌标准菌株（ATCC14028），
12株A-F 群O 价沙门氏菌分别为：甲型副伤寒沙门氏菌（IQCC10518）、乙型副伤寒沙门氏菌（IQCC10504）、
猪霍乱沙门氏菌（IQCC10502）、病牛沙门氏菌
（IQCC10510）、肯塔基沙门氏菌（IQCC10530）、布伦登卢普沙门氏菌（IQCC10542）、伤寒沙门氏菌（IQCC10593）、肠炎沙门氏菌（IQCC10512）、鸭沙门氏菌（IQCC10509）、山夫登堡沙门氏菌（IQCC10520）、阿伯丁沙门氏菌（IQCC10511）、旺兹沃斯沙门氏菌（IQCC10515），对照菌株（大肠杆菌IQCC10103）均来源于中国检验检疫科学研究院菌种保藏中心（IQCC ）。1.1.2样品
鸡胸肉，购自北京市场。1.1.3
主要仪器与设备
微量移液器（10μL ，
100μL ，200μL ，1000μL ，德国Eppendorf 公司）；实时荧光定量PCR 扩增仪（Mastercycler ep realplex ，德国Eppendorf 公司）；电泳
仪（DYY-6C ，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（Gene Genius ）；倒置生物显微镜（DMI3000B 、DM6000B ，德
国LEICA 公司）；全波长酶标仪（Multiskan Spectrum ，美国Thermo 公司）；全自动微生物分选仪（BeadRe-triever TM ，美国Invitrogen 公司）；磁力架（Promega 12well magnetic perator ）。1.1.4
主要试剂
脑心浸液肉汤（BHI ）（美国Difico 公司）；营养琼脂（北京陆桥公司）；API20E （法国生物梅里埃公司）；
绝命毒师第四季核壳式聚苯乙烯羧基化磁性微球（0.5%，100nm 、700nm 、3μm 、5μm ）（天津倍思乐色谱技术开发中
心）；碳二亚胺（EDC ）（上海共价化学）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS ）（上海共价化学）；牛血清白蛋白（BSA ，美国GeneMay 公司）；PBS 缓冲液（1000mL
无菌水中溶解KH
2PO
4
0.2g，KCl0.2g，Na
2
HPO
4
·
12H
2
O2.9g，NaCl8.0g，高压灭菌）；洗涤缓冲液（pH8.0的Tri-HCl，含0.05%Tween20）；封闭液（含1%BSA的PBS溶液）；Dynalbeads抗沙门氏菌免疫磁珠试剂盒（美国Invitrogen公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Novagen）；Faststart universal probeMaster （Rox）（Roche公司）。
1.2实验方法
escalator1.2.1免疫磁珠制备及其捕获效率测定
1.2.1.1抗体制备
将12株A-F群O价沙门氏菌菌株在脑心浸液培养液中37ħ培养18 24h，经沙门氏菌显色培养基平板划线纯化，获得纯培养菌悬液，送至上海英骏生物技术有限公司，制备抗沙门氏菌免疫血清，分离纯化得到沙门氏菌属多克隆抗体，分装，于－20ħ冷冻保存。
1.2.1.2免疫磁珠制备
免疫磁珠制备过程，参考李玲等的方法［4］，并略作改动，具体操作如下：
磁性微球活化：取500μL羧基磁性微球至1.5 mL离心管中，用1mL PBS缓冲液洗涤2次后，加入PBS缓冲液50μL重新悬浮；加入新配制的浓度为6 mg/mL，pH为6.6的EDC及NHS溶液各200μL，室温（24ħ）振荡（500r/min）活化反应20min，上磁力架除去液相；用1mL PBS缓冲液振荡清洗3次，上磁力架除去液相。
磁性微球与抗体固化：加入100μg/mL的抗沙门氏菌多克隆抗体100μL，37ħ振荡（500r/min）固化2h，上磁力架，收集液相，测定固化后剩余抗体浓度，以确定固化效率；用1mL的洗涤缓冲液振荡清洗3次，上磁力架除去液相。
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封闭：加入100μL封闭液，37ħ振荡（500r/ min）封闭1h；用1mL洗涤缓冲液振荡清洗3次，上磁力架除去液相。
重悬：加入100μL PBS缓冲液重悬，4ħ保存备用。
1.2.1.3免疫磁珠制备条件优化
磁性微球的粒径，抗体浓度，磁性微球与抗体的固化时间及EDC、NHS的浓度为影响免疫磁珠分离效率的主要因素，本研究针对这些因素，进行了一系列条件的优化选择，确定固化效率最高者为最佳制备条件［5］。参照BCA蛋白定量试剂盒说明书，测定蛋白质标准溶液的OD值，制定标准曲线，计算得被测蛋白质溶液浓度。通过测定固化前抗体浓度和固化后剩余抗体浓度，计算固化效率。
固化效率/%=（固化前抗体浓度-固化后剩余抗体浓度）/固化前抗体浓度ˑ100
磁性微球粒径的确定：选择粒径为100nm、700 nm、3μm、5μm的羧基聚苯乙烯磁性微球，与抗体进行固化反应，分别测定固化效率，进行3次重复试验，取平均值，确定最适磁性微球粒径。
dasd抗体浓度的确定：选择最适粒径的磁性微球，按上述方法进行活化，分别将抗沙门氏菌血清进行10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍稀释，与磁性微球固化，分别测定固化效率，进行3次重复试验，取平均值，确定最适抗体浓度。
固化时间的确定确定磁性微粒的粒径及最佳抗体浓度后，将抗体与磁性微球的固化时间设为0.5、1、1.5、2、2.5h，与抗体进行固化反应，分别测定固化效率，进行3次重复试验，取平均值，确定最适固化时间。
EDC和NHS浓度的确定将pH值为6.6的EDC 和NHS浓度各自设为1 8mg/mL后进行浓度梯度组合，分别活化已确定粒径的羧基磁性微球，再与抗体进行固化反应，进行3次重复试验，取平均值，确定最适EDC和NHS浓度。
1.2.1.4免疫磁珠捕获沙门氏菌菌悬液中目的菌
按照BeadRetriever全自动微生物分选仪操作规程，安装好磁免疫筛选设备。将沙门氏菌菌悬液及免疫磁珠加入筛选系统中，选择相应的筛选程序“Sal-monella”进行沙门氏菌筛选（该程序持续22min左右）。筛选结束后，将富集后的复合物100μL转移至1.5mL离心管，进行实时荧光PCR检测或进行适当稀释，选择合适梯度平板计数，计算免疫磁珠捕获效率。
1.2.1.5免疫磁珠捕获效率的测定
将沙门氏菌加入脑心浸液肉汤过夜培养，菌落计数后将菌液浓度调整为104CFU/mL，分别取自制免疫磁珠悬液12，25，50，100μL，加入沙门氏菌细菌稀释液1mL，参照步骤1.2.1.4进行沙门氏菌筛选，
收集后的复合物100μL，做10倍递减稀释，取最佳稀释度菌液100μL进行平板菌落计数，每个试验重复3次，计算免疫磁珠的捕获率，选择捕获效率最高者为最适免疫磁珠添加量。同时以市售沙门氏菌免疫磁珠试剂盒作为比较。
免疫磁珠捕获率/%=（磁分离后的菌落数/磁
分离前的菌落数）ˑ100
1.2.2免疫磁捕获-实时荧光PCR方法建立
experiments
参照1.2.1.4步骤对菌悬液中沙门氏菌筛选结束后，将富集后的复合物100μL转移至1.5mL离心管，热裂解法提取DNA，进行实时荧光PCR检测。
引物和探针：根据Genbank中沙门氏菌属inv A 基因序列和文献报道［6］，确定用于inv A基因扩增的特异性引物及探针：上游引物（5＇-GCGTTCTGAAC-CTTTGGTAATAA-3＇）、下游引物（5＇-CGTTCGGGCAAT-TCATTA-3＇）及探针（5＇FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTT-GTCTTCT-TAMARA3＇），由上海英骏生物技术有限公司合成。
热裂解法提取DNA［7］：筛选后的免疫磁珠-沙门氏菌复合物于100ħ沸水裂解10min，冰浴5min，再经8000r/min离心5min后，取上清液50μL作为实时荧光PCR扩增模板。
扩增反应及体系扩增体系如下：25μL反应体系中包括Faststart Mastermix12.5μL；上下游引物各200nM；探针200nM；DNA模板5μL；6μL无菌双蒸水。反应程序为：95ħ10min，95ħ15s，60ħ1min，45个循环，设立阴性（大肠杆菌IQCC10103）及空白（无菌双蒸水）对照。
1.2.3免疫磁捕获-实时荧光PCR方法检测限的确定
将过夜培养的沙门氏菌标准菌株菌悬液，以0.85%灭菌生理盐水作10倍梯度稀释。取不同浓度梯度的菌悬液各1mL，加入自制免疫磁珠至筛选系统中，参照步骤1.2.1.4进行沙门氏菌筛选，将筛选后的复合物提取DNA，实时荧光PCR检测，确定免疫磁捕获-实时荧光PCR方法的检测限。
1.2.4免疫磁捕获-实时荧光PCR检测鸡肉模拟样品中沙门氏菌
准确称取25g鸡肉样品，加入225mL0.85%无菌生理盐水于无菌均质袋中，均质器拍击30s。取各稀释梯度的沙门氏菌标准菌株菌悬液0.5mL，加入4.5mL均质后的样品上清液，振荡混合均匀，得到沙门氏菌鸡肉模拟添加样品。
取不同浓度梯度的鸡肉模拟样品1mL，加入自制免疫磁珠，参照步骤1.2.1.4进行沙门氏菌筛选，将筛
选后的复合物提取DNA，实时荧光PCR检测，确定免疫磁捕获-实时荧光PCR方法对沙门氏菌模拟样品的检测限。2结果与分析
2.1免疫磁珠制备条件优化结果
采用BCA蛋白定量试剂盒测得固化前抗体浓度为4.0mg/mL。从磁性微球的粒径，抗体浓度，磁性微球与抗体的固化时间及EDC、NHS的浓度4方面优化免疫磁珠制备条件，优化结果如下：
2.1.1磁性微球粒径的选择
不同粒径的磁性微球与抗体的固化效率不同。本研究对比了100nm、700nm、3μm、5μm4种粒径的磁性微球与抗体的固化效率，以确定最适粒径的磁性微球。实验结果表明：随着磁性微球粒径减小，其比表面积随之增大，与抗体的固化效率逐渐增大；粒径为100nm的磁性微球与抗体固化效率最高，达93.80%（图1A），但此时微球间的聚集重叠较明显，磁性微球聚沉现象严重，分散不均匀，经超声波超声分散后，很快又聚集呈团状，不稳定。综合考虑，本研究选择粒径700nm的磁性微球作为后续实验的材料，此时磁性微球与抗体固化效率为90.07%。
2.1.2抗体浓度的确定
本研究对比了10倍，20倍，40倍，80倍，160倍，320倍稀释的抗沙门氏菌血清，以确定最适抗体浓
度。实验结果表明：随着稀释倍数增加，固化效率也逐渐增加，当抗体稀释倍数为40倍时，固化效率达到99.77%，当稀释倍数继续增大时，固化效率不再增加，甚至会降低，抗沙门氏菌血清稀释160倍时，固化效率达到最低，而当稀释倍数继续增加至320倍时，固化效率又有上升趋势，但此时磁性微球上固化抗体的绝对量过少（图1B）。因此，确定抗体的最适固化浓度为原液稀释40倍后的浓度，即100μg/mL。
2.1.3固化时间的选择
本研究分别选用0.5，1，2，2.5和3h的抗体与磁性微球的固化时间，以确定最适固化时间。结果显示：随着固化时间的增加，固化效率也逐渐增强，在1.5h时固化效率达到最大，固化效率为99.26%，随着固化时间继续增加，固化效率不再增强，且由于固化过程可能会将已固化到磁珠表面的抗体振荡脱落下来，导致固化效率降低（图1C）。因此，选择1.5h 作为抗体与磁性微球的最适固化时间。
2.1.4EDC和NHS浓度的选择
将EDC和NHS浓度各自设为1 8mg/mL，以确定最适EDC和NHS浓度。表1为经不同浓度EDC和NHS活化后的磁性微球与抗体固化的固化效
率。结果表明，当EDC 和NHS 溶液浓度分别为6mg /mL 和5mg /mL 时，固化效率最大，达到97.14%。
因此，选择6mg /mLEDC 和5mg /mLNHS 活化磁性微
球。
图1磁性微球与抗体固化条件优化结果表1
固化效率随EDC 和NHS 浓度变化表
固化效率/
%
EDC 浓度/（mg ·mL －1）
12345678NHS 浓度/（mg ·mL
－1
）
179.7184.4076.0982.4490.8578.0584.7879.14285.9482.2077.5784.1685.3196.0890.6589.393
91.6081.0181.1889.7493.4195.4689.4494.754
76.6582.3796.1387.3290.4895.0688.1182.71584.9386.1492.5291.1296.1497.1492.8288.41691.6281.3785.2489.1588.0794.1790.2587.39795.1879.2791.1091.4689.7994.8488.6184.848
94.11
88.93
93.79
86.40
96.31
the fray
96.12
87.42
anyhow94.00
经一系列制备条件的优化，最终确定以6mg /mL
EDC 和5mg /mL NHS 活化700nm 粒径的羧基聚苯乙烯磁性微球，
与浓度为100μg /mL 的抗沙门氏菌抗体在37ħ振荡孵育1.5h ，再经封闭，清洗等过程，制备得到抗沙门氏菌免疫磁珠。2.2免疫磁珠捕获效率的测定
将沙门氏菌菌悬液与不同量的免疫磁珠反应，对磁捕获后的复合物进行适当稀释，在37ħ条件下培养48h 后，计算菌落总数。
菌落总数（CFU /mL ）=同一梯度下3个培养皿
的菌落数之和/［
3ˑ10ˑ该计数培养皿的稀释倍数］计算得磁分离前的菌落数为5.2ˑ108
CFU /mL ，不同添加量的免疫磁珠捕获效率见表2。
表2
不同添加量的免疫磁珠捕获效率
不同免疫磁
珠量/μL
菌落总数ˑ10－7/（CFU ·mL －1）
平行1平行2平行3平均值
捕获效率/%121210710ʃ2.518.6ʃ4.842525252124ʃ2.345.5ʃ4.445032364136ʃ4.569.9ʃ8.67100
48
46
57
50ʃ5.996.8ʃ11.27
由表2可知，随着免疫磁珠量不断增加，捕获效
率不断提高，当免疫磁珠添加量为100μL 时，捕获效率最高，达96.8%，即此时免疫磁珠几乎可以捕获
104CFU /mL 沙门氏菌菌悬液中全部目的菌，后续实验均采用100μL 免疫磁珠进行磁捕获。相同条件
下，
用100μL 市售免疫磁珠试剂盒做为比较，捕获效率达97.4%，
两种免疫磁珠捕获效率经t 检验（P =0.95）无显著性差异，即自制免疫磁珠捕获效率与市售免疫磁珠捕获效果相当，但成本比市售免疫磁珠低。2.3
免疫磁捕获-实时荧光PCR 方法检测限的确定
在确立了最适免疫磁珠添加量的基础上，取不同
浓度梯度的菌悬液各1mL ，加入100μL 免疫磁珠进行磁捕获，实时荧光PCR 检测结果见图2，其中以CT 值小于45确定为阳性扩增信号，能检测到的最低菌
液浓度即为该方法的检测限。结果显示，
该方法对于109 104CFU /mL 浓度的菌悬液均显示出阳性信号，
更低浓度为阴性信号，确定该方法的检测限为10
4
CFU /mL 左右。2.4
鸡肉模拟样品免疫磁捕获-实时荧光PCR 检测限确定
取不同浓度梯度的鸡肉模拟样品1mL ，各加入
100μL 自制免疫磁珠，免疫磁捕获后，进行实时荧光
PCR 检测结果显示，该方法对108 104CFU /mL 沙
门氏菌均检出阳性信号，更低浓度检出阴性信号（图voip是什么
图2
免疫磁捕获-实时荧光PCR 检测限
阳性对照：沙门氏菌标准菌株DNA ；阴性对照：大肠杆菌DNA ；空白对照：无菌水
3）。结果表明，免疫磁珠表面抗体与样品中目的菌
抗原特异性结合，有效去除了食品样品中抑制PCR 扩增的成分，提高了检测的灵敏度，可联合实时荧光PCR 检测法与免疫磁珠富集技术检测浓度为104CFU /mL 的鸡肉样品。
阳性对照：沙门氏菌标准菌株DNA ；阴性对照：大肠杆菌DNA ；空白对照：无菌水
图3自制免疫磁捕获-实时荧光PCR 检测模拟添加样品结果
3结论
免疫磁珠（IMB ）是由磁性微球表面固化抗原或
抗体等免疫活性分子构成，是免疫学和磁载体技术结
合而发展起来的一项免疫学技术，可应用于检验检疫、卫生防疫和食品安全检验等领域
［8－9］
。现国内外
已有利用免疫磁珠富集食品中沙门氏菌，但大多采用
免疫磁珠试剂盒结合传统培养法进行检测，操作费时费力，且价格昂贵，无法得到普遍应用。王海明
［10］
等
利用英国MATRIX 公司的抗沙门氏菌免疫磁珠试剂
盒捕获目的菌，捕获后的复合物直接在显色培养基中培养，检测周期约为40h ；Leon
［11］
等利用Dynalbeads
抗沙门氏菌免疫磁珠，结合酶联免疫（EIA ）反应检测
禽肉中的沙门氏菌，可在48h 内检测到样品中104
106CFU /mL 浓度的沙门氏菌。本研究将免疫磁珠捕获与实时荧光PCR 方法结合，建立了免疫磁捕获-实时荧光PCR 快速检测方
法，
检测限为104
CFU /mL 左右，可在16h 内检测出鸡肉中104
CFU /mL 的沙门氏菌。本实验制备的免疫磁珠与市售沙门氏菌免疫磁珠试剂盒（Dynal 产
品）捕获效率相当，但成本较低，同时由于本研究制备的沙门氏菌多克隆抗体，是利用国内具有代表性的A-F 群O 价沙门氏菌进行免疫得到的，对于我国食品
中沙门氏菌的快速分离和检验有着重要的应用价值。
参
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