赤潮叉角藻18S rD NA 和ITS 区
序列测定与分析
3
庄 丽 陈月琴1)
李钦亮 屈良鹄
(中山大学生物工程中心 广州 510275)
(国家海洋局北海监测中心 青岛 266033)
提要 采用PCR 及克隆测序的方法，对1998年引发渤海赤潮的叉角藻18S rRNA 基因及
rDNA ITS 区(Internal Transcribed Spacer Regions )进行了序列测定与分析。并通过因特网从
国际分子生物学数据库中获取甲藻另外15个种的18S rDNA 序列，以Tet rahymena corlissi 作为外类群，分别采用Neighbor 2Joining 和Fitch 方法构建了甲藻较为一致和可靠的进化树图，探讨具有高度多样性和在分类上争议较多的甲藻各类群之间的形态与分子进化关系。结果表明,Prorocent rum (有2个简单的
壳板)出现得较早，而大多数多甲藻目(覆盖着多个壳
板)、裸甲藻目(大多数不具壳板)和膝沟藻目的成员较晚出现。另外，对叉角藻ITS 区的分析表明,ITS 区为高变区，是良好的分子标记，可用于叉角藻快速鉴定的专一性核酸分子探针的研制。
关键词 叉角藻,18S rDNA ,ITS 区，形态演化，分子进化中图分类号 Q75
甲藻(dinoflagellate )是重要的浮游植物类群，是形成海洋灾害———赤潮的主要门类。甲藻中有120多种能形成赤潮，近60种为有毒种类(齐雨藻,1999)。叉角藻(Cerati um f urca )为其中一种，是诱发1998年渤海赤潮的原因种之一。面对日益恶化的海洋环境，赤潮发生频率不断增加，因此，对沿海海域诱发赤潮发生的海洋甲藻进行快速准确的检测、鉴定及监控是目前赤潮生物学和环境学研究的热点之一(洪君超等,1994；黄奕华等,1997；何家菀等,1999；黄长江等,2001)。
甲藻具有很高的形态多样性，同时某些形态特征具有可变性，其野生种和实验室培养种有较大差异，加上有关甲藻分类方法缺乏较为完整、系统的指导性标准，因此目前对甲藻分类存在较大的争议。如分类学中探讨甲藻各大类群演化关系的主要依据是鞭毛的着生位置及壳板的数目和形状，但是，这些性状具有可变性，当涉及到各类之间的演化关系时，存在较多问题。例如：无细胞壁或细胞壁很薄的裸甲藻(大多数不具壳板)和多甲藻(覆盖着多个壳板)相比，哪一种更为原始?等等。
20世纪90年代以来，分子生物学技术的迅速发展，为探讨甲藻分子进化问题及分类
3国家自然科学基金资助项目,39770058号。庄 丽，女，出生于1972年4月，硕士生,E -mail :lsbrc04@zsu.edu
1)通讯作者
收稿日期:1999-10-08，收修改稿日期:2000-03-20
第32卷 第2期
slogan是什么意思2001年3月 海 洋 与 湖 沼OCEANOLO GIA ET L IMNOLO GIA SIN ICA
Vol.32,No.2Mar.,2001
会计学基础知识点鉴定提供了新的手段(Inagaki et al ,1997;Zardoya et al ,1995)。目前，被广泛应用于甲藻系统发育研究的分子指标有大分子rDNA 及其基因间隔区ITS 区(Internal Transcribed Spacer )等。本研究对我国海区分离到的赤潮叉角藻18S rDNA 及ITS 区进行序列测定及分析，拟找出其特征性核苷酸序列，为研制快速鉴定赤潮叉角藻的核酸分子探针奠定基础。同时应用距离矩阵方法，对属于甲藻纲多甲藻目(Peridiniales )等各大目的16个代表种的18S rDNA 进行序列比较分析，探讨其形态与分子进化之间的关系以及进化模式。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的藻种为赤潮叉角藻(Cerati um f urca )，采自辽宁省葫芦岛市港内，由国家海洋局北海监测中心生物室李钦亮工程师鉴定。另外16个种的rDNA 序列来自基因库，见表1。
表1 本研究所用材料的种名、缩写、所属目及在基因库中的注册号码
Tab.1 List of the investigated dinoflagellate species ,their abbreviation ,order ,and G enbank accesstion number
亲人的英文单词
种名土电话
缩写
所属目
注册号码
Cerati um f urca
C.f r.G onyaulacales AJ276699Prorocent rum panamensis P.p.Prorocentrale PSPY16233Gy m nodi
ni um catenat Gymnodiniales AF022193Gy m nodi ni um miki Gymnodiniales AF022195Gy m nodi ni um sp.G.sp.Gymnodiniales AF022196L epi dodi ni um vi ri de L.v.Gymnodiniales AF022199Cryptoperi di niopsis brodyi C.b.Cryotoperidioiales AF08097Heterocapsa t riguet ra
<
Hymenostomatida
TCU17356
1.2 D NA 的制备、18S rD NA 和ITS 区的PCR 扩增反应
1.2.1 DNA 的制备 从显微镜下挑取数个藻细胞(经福尔马林固定)于0.5ml 的离心
管中，加入25μl 提取缓冲液(1%SDS ,10mmol/L ED TA ,p H =810,10mmol/L Tris -HCl ,p H =715,10mmol/L NaCl )，采用本实验室研制的DPS 纯化系统直接从提取缓冲液中获取微量DNA ，用于PCR 扩增(陈月琴等,1997)。1.2.2 18S rDNA 和ITS 区的PCR 扩增反应 18S rDNA PCR 引物为:Dino18N1:5’TGTCTCAAA G A TTAA GCCA TG 3’,Gym18(-):5’ACTTCTCCTTCCTCTAA GTG A3’，分别对应于18S rDNA 的5’末端和3’末端区域，为甲藻的专一性引物;rDNA ITS 区扩增
9
412期 庄 丽等：赤潮叉角藻18S rDNA 和ITS 区序列测定与分析
引物为L H 2:5’A GGTG AACCTGCGG AA GG A TC3’,Dlam (甲藻专一性引物):5’CCT 2
GCA GTCG ACA (TG )A TGCTTAA (A G )TTCA GC (A G )GG 3’，分别对应于18S rDNA3’末
端和24S rDNA5’末端区域；在中国科学院上海生物化学研究所合成。扩增完成后，取2μl 于1%的琼脂糖凝胶电泳检查，其余在-20℃保存备用
。
图1 引物Dino 18N1(+)和G ym18(-)、L H 2和
Dlam 分别扩增赤潮叉角藻18S rDNA 及ITS 区示意图contenttype
Fig.1 Diagram of PCR amplification of 18S rDNA and ITS
regions of Ceratium f urca by using Dino 18N1(+)/Gym18(-)and L H 2/Dlam ,respectively 1.3 rD NA PCR 扩增产物的序列测
定、比较分析与数据处理
PCR 扩增产物经Q IAquick spin column 系统纯化后，与质粒PTZ19连接、克隆(萨姆布鲁克等,1992)。使用377型自动测序仪(AB I PRISM )测定
重组质粒的DNA 序列。
按照最大同源性的原则将所测得序列进行排列，序列中引入适当数量的空位(G ap )，以便达到最大可能的同源性。采用计算机分析软件包Phylip35(Felnstein ,1993)1)中的DNAdist 程序进行序列核苷酸差异值(Knuc values )的计算，再
以Neighbor 2Jioning 和Fitch 方法构建甲藻分子系统进化树。
图2 赤潮叉角藻18S rDNA 及ITS
区扩增
Fig.2 18S rDNA and ITS regions PCR amplification of red tide -related
Ceratium f urca
M.2kb marker ;1.18S rDNA ;2.rDNA ITS
2 结果与讨论
2.1 甲藻18S rD NA 及ITS 区的PCR 扩增
由于所采集的样品为赤潮发生时自然水体，除含有叉角藻外，显微镜下观察还有链状亚历山大藻和鳍甲藻及原生动物等。为了避免其它藻类和原生动物的
影响，直接在显微镜下挑取单个叉角藻，采用单个细胞法进行DNA 提取和PCR 扩增，具有较好的重复性，且该方法不依赖微藻培养技术的完善。同时，为了避免18S rDNA 5’端的“假结”结构，设计了甲藻专一性引物
Dino18N1(+)、Cym18(-)和D1am ，分别为甲藻属
18S rDNA 5’末端(32-52)和3’末端,24S rDNA 5’末端保守序列。PCR 结果见图2。18S rDNA PCR 产物约为1700bp ;rDNA ITS 区则约为500bp (包括18S 3’末端和24S 5’末端rDNA 部分序列)。2.2 叉角藻18S rD NA 的序列测定与分析叉角藻18S rDNA PCR 产物经纯化、克隆后于自动测序仪进行序列测定，共测得1841碱基对核苷酸序列，其G +C 含量为4411%。
将所测得序列输入国际分子生物学数据库(G enbank )，并通过因特网从国际分子生
1)Felnstein J ,1993.Phylip -Phylogeny Inference Package ,Version 3.5.Distributed by the author ,Department of
G enetics ,University of Washington ,Seattle
051海 洋 与 湖 沼 32卷
物学数据库中获取甲藻另外15个种的18S rDNA 序列。序列分析比较结果表明，角藻属的3个种:Cerati um f urca 、C.tenue 和C.f usus 的18S rDNA 具有很高的保守性。如在611位点，此3个种皆为A ，而其余13个甲藻为G 。又如在461位点，此3个种皆为T ，而其余13个甲藻皆为C 。2.3 叉角藻ITS 区序列测定与分析虚拟语气的用法
共测得叉角藻ITS 区序列438bp 。其中,ITS1为149bp ,518S 为157bp ,ITS2为132bp 。
通过因特网从国际分子生物学数据库中获取甲藻另外6个种的ITS 区序列进行分析比较。结果表明，所测定的叉角藻ITS 区长度与同一个目的另外一个种A lex andri um
pudogonyaulax 较为相似。同时也发现，甲藻四大目之间518S rDNA 非常接近，都在
160bp 左右，表明518S rDNA 是一个非常保守的区域。该结果还表明，无细胞壁或细胞壁
较薄的裸甲藻类ITS 区较长；有2个简单壳板的原甲藻类次之；膝沟藻目较短；而细胞壁覆盖着较多壳板的多甲藻目ITS 区最短。ITS 区长度从裸甲藻ϖ原甲藻ϖ膝沟藻ϖ多甲藻呈现规律性的递减，这是否预示着甲藻这四大目之间在分子进化方面存在某种趋势?此问题有待进一步研究。
另外，对叉角藻ITS 区的分析表明,ITS 区为高变区，是良好的分子标记，可用于快速鉴定叉角藻的专一性核酸分子探针的研制。这些结果为赤潮叉角藻的鉴定及系统学研究提供了分子基础。
表2 甲藻5.8S rDNA and ITS 区长度的比较
Tab.2 Length of the 5.8S rDNA and ITS regions among veral ITS types
种名
所属目
初中英语语法练习题
ITS1 5.8S ITS2总长度(bp )注册号码
Cerati um f urca G onyaulacales 149157132438AJ276700Coolia monotis Peridiniales 165163>27>355AF076467Ost reopsis lenticularis
Peridiniales 166156>44>366AF076217A lexandri um pudogonyaulax G onyaulacales 184161165510Aboo6997Prorocent rum micans Prorocentrales 211160199565PMIRG17S Gy m nodi ni um sangui neum Gymnodiniales 260160237657AF131075Gyrodi ni um i m pudicum
Gymnodiniales
179
katy perry 格莱美160
268
607
AF131074
2.4 甲藻形态与分子进化
目前，世界上现存甲藻约4000多种，包含两大类:Dinophyceae 和Syndinophyceae 。
Syndinophyceae 仅为少数的寄生种类，约40个种，而通常所指的甲藻主要为前者———Dinophycea
e 。
鞭毛的着生位置及壳板的数目和形状是Dinophyceae 目间分类的主要依据，据此划分出多甲藻(Peridiniales )、原甲藻(Prorocentrales )、膝沟藻(G onyaulacales )、鳍藻(Dino 2physiales )和裸甲藻(Gymnodiniales )等目，为现存甲藻主要代表，也是海洋甲藻的常见类群。目前，根据壳板的数目和排列方式，存在三种解释甲藻各目间系统关系的假说。(1)壳板递增模型 从生物学角度推断有壳板的原甲藻目和多甲藻目代表较原始的类群，而裸甲藻目是分化或更先进的类群。
1
512期 庄 丽等：赤潮叉角藻18S rDNA 和ITS 区序列测定与分析
(2)壳板递减模型 根据中生代的化石记录，认为大量的薄壁发展成较少数目的
cora
壳板，因而裸甲藻目是最原始的，原甲藻目较为先进。
(3)壳板断裂模型 结合生物学和古生物学证据，认为原甲藻目代表最古老的一支，其细胞壁由两块壳板组成，通过壳板分化成膝沟藻和多甲藻；而另有一支通过壳板减少演化成不被壳的裸甲藻(Bujak et al ,1981;G oodman ,1987)。由于缺乏足够的证据，这些假说未能得到进一步的证实和发展
。
rest in peace图3 以Fitch 方法构建的甲藻分子系统树
Fig.3 Dinoflagellate phylogeny tree bad on the distance
matrix using the Fitch method
注：以Tet rahymena corlissi 作为外类群，根据核苷酸差异值
(Knuc values )计算
在测定和分析叉角藻18S rRNA 基因的基础上，从国际分子生物学数据库(G enbank )中获取甲藻另外15个种的18S rDNA 序列。采用Phylip35计算机分析软件中的Seqboot 程序生成100个自展数据集；以Tet rahymena corlissi 作为外类群，应用Neighbor -Jionig
method 和Fitch 方法1)
，经Conn 2sus 程序计算多数一致树，构建了较为一致的甲藻分子系统树(图3)。从图3可以看出，甲藻的演化
大致可以分为两大分支，一支为膝
沟藻目的甲藻株系；另外一支中，属于多甲藻目的Peri di ni di um sp.先出现，接着是原甲藻目的Proro 2cent rum panamensis 和Phyto 2
diniales 目的Gloeodi ni um viscum ，再接着分为两支，分别为多甲藻目和裸甲藻目的成员。
传统的鉴定裸甲藻方法是按照其很不明显的形态学特征(即不披壳)来决定的，这远远不足以建立可靠的分类系统，因此，分子生物学方法可能是对其一个很好的补充。这也解释了为什么按照形态学特征鉴定为裸甲藻的Gym nodi ni um m iki motoi 在系统树中与多甲藻目的成员较为接近，而与裸甲藻目的其它株系相隔较远。
从系统树上还可以看出,Prorocent rum panamensis (有2个简单的壳板)的出现相对较早，而大多数多甲藻目(覆盖着多个壳板)、裸甲藻目(大多数不被壳)和膝沟藻目(覆盖着多个壳板)的成员较晚出现，且出现的时间比较接近，表明甲藻各大目之间是平行演化的。同时还表明裸甲藻细胞裸露可能是次生演化的结果。这些结论与Lenaers 等(1989,1991)根据24S rRNA 序列分析得到的结果大部分一致。Lenaers 等(1989,1991)通过分析甲藻7个目13个种的24S rRNA 高变区D1和D8序列，以Tet rahymena thermophila 为外类群构建系统树，发现原甲藻、多甲藻和裸甲藻都不是最原始的类群，而是较晚出现的平行发展的较为先进的类群。Zardoya 等(1995)对原甲藻、多甲藻和裸甲藻3个目10
1)同第153页脚注
251海 洋 与 湖 沼 32卷
