61微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）
此章提供方式来检测可能存在的好氧微生物其他制药进程中可能显现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。若是通过验证确认能够取得相同或更好的检测结论，也许诺采纳自动化的检测方式。在样品检测进程中须进行无菌操作。假设无专门说明，那么“培育（incubate）”一词指在30—35℃的培育箱内培育24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
预备实验 (Preparatory Testing)
本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明可不能抑制可能存在的微生物的生长。因此，在预备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培育物的培育基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。方式如下：将用肉汤培育基培育24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培育物，加1 ml（微生物）培育液到磷酸(盐)缓冲液(pH ，液体大豆酪蛋白消化物培育基（Fluid Soybean-Cain Digest Medium），或液体乳糖培育基（Fluid Lacto Medium）。相应培育基培育失败那么需要采取以下方式更改检测程序：
（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或
（2）中和必然数量的干扰因子；或
（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成份和浓度，该物质及浓度可用于加入培育基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, %）或聚山梨醇酯20（polysorbate 20, %）。然后重复前面的实验，用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20（Fluid Cain Digest-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium）论证待测样品里的防腐剂或其他抑菌因子被中和。假设产品中含有抑菌物质且产品是可溶性的，那么采纳“无菌实验（Sterility Tests <71>）”里的“薄膜过滤法 (Membrane Filtration Method)”进行(微生物限度)检测会更适宜（suitable）。
在抑菌物质得以适当中和、稀释液体积大幅度增加后仍不能排除抑制因子，和不适宜用“薄膜过滤法”的情形下，可能会因为产品本身的杀菌作用致使细菌无法生长。当产品不能检测出接种菌种的情形下，应用光谱法确信产品的抑菌/杀菌成份。
缓冲液和培育基 (Buffer Solution and Media)
依照以下配方配制培育基，或利用标准厂商生产的培育基干粉进行培育基配制，所利用的干粉培育基应该与在此列出的培育基成份比例相似。
在按列出的配方进行培育基配制时，用水溶解固体物质，必要时能够加热以取得完全溶解的均匀溶液。在利用前用盐酸或氢氧化钠将培育基的pH值调剂到要求范围，调剂pH值应在25±2O条件下进行。
假设培育基配方有琼脂，应利用湿度不超过15%的琼脂。溶解水为纯化水（Purified Water）。
PH 磷酸(盐)缓冲液
储蓄液——称34g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶，加水500mL溶解。用氢氧化钠TS调剂pH 至±（约175mL），然后加水至容量瓶刻度，混匀。分装溶液后灭菌。冰箱保留。
培育基
除还有指出，培育基应在高压灭菌器中加热灭菌。（见<1211>“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”）。保留时刻（exposure time）取决于培育基的灭菌体积。
一、液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20培育基
酪蛋白胰酶消化物------------------20g
大豆卵磷脂-------------------------5g
聚山梨醇酯20---------------------40mL
水-------------------------------960mL
将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于960mL水中，48~50℃水浴加热约30分钟得均匀溶液。加40mL聚山梨醇酯20，混匀，按需要分装。
二、大豆酪蛋白消化物琼脂培育基
酪蛋白胰酶消化物-----------------15.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物------------5.0g (Papaic Digest of Soybean Meal)
a bite of china氯化钠----------------------------5.0g
琼脂-----------------------------15.0g
水------------------------------1000mL
灭菌后pH值：±
3、液体大豆酪蛋白消化物培育基
依照<71>无菌实验里的方式进行配制。
酪蛋白胰酶消化物------------------17.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物-------------3.0g
氯化钠-----------------------------5.0g
磷酸氢二钾-------------------------2.5g
葡萄糖（C6H12O6 H2O）--------------2.5g
纯化水---------------------------1000mL
4、甘露醇-盐琼脂培育基
酪蛋白胰酶消化物-------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物-------------5.0g
牛肉膏-----------------------------1.0g
D-甘露醇--------------------------10.0g
氯化钠----------------------------75.0g
琼脂------------------------------15.0g
酚红-----------------------------0.025g
水-------------------------------1000mL
混匀，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。灭菌后pH值：±
五、Baird-Parker琼脂培育基
酪蛋白胰酶消化物-------------------10.0g
牛肉膏------------------------------5.0g
酵母膏------------------------------1.0g
氯化锂------------------------------5.0g
琼脂-------------------------------20.0g
氨基乙酸（糖胶）-------------------12.0g
丙酮酸钠---------------------------10.0g
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水---------------------------------950mL
搅拌加热，煮沸1分钟。灭菌，冷却至45~50℃，然后加入10mL灭菌后的亚碲酸钾（1:100）和50mL乳状蛋黄。轻柔混匀。
六、Vogel-Johnson 琼脂培育基
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
酵母膏-----------------------------5.0g
甘露醇----------------------------10.0g
磷酸氢二钾-------------------------5.0g（Dibasic Potassium Phosphate）
氯化锂-----------------------------5.0g
氨基乙酸（糖胶）------------------10.0g
琼脂------------------------------16.0g
酚红
水-------------------------------1000mL
溶解后煮沸1分钟。灭菌，冷却至45~50℃，然后加20mL灭菌后的亚碲酸钾（1：100）。
灭菌后pH值：±
7、溴棕三甲铵琼脂培育基
白明胶胰酶消化物-------------------20.0g
氯化镁------------------------------1.4g
硫酸钾-----------------------------10.0g
琼脂-------------------------------13.6g
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溴棕三甲铵--------------------------0.3g
mnm
丙三醇
水--------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：±
八、假单胞菌琼脂培育基检测荧光生二氢荧光素
酪蛋白胰酶消化物-------------------10.0g
动物组织胃蛋白酶消化物-------------10.0g
无水磷酸氢二钾----------------------1.5g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）---------------1.5g
丙三醇
琼脂-------------------------------15.0g
水--------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：±
九、假单胞菌琼脂培育基检测绿脓菌溶素
白明胶胰酶消化物--------------------20.0g
无水氯化镁---------------------------1.4g
无水硫酸钾--------------------------10.0g
琼脂--------------------------------15.0g
丙三醇
水---------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：±
10、液体乳糖培育基
牛肉膏------------------------------3.0g
白明胶胰酶消化物--------------------5.0g
乳糖--------------------------------5.0g
水--------------------------------1000mL
灭菌后需尽快冷却。
灭菌后pH值：±
brothers and sisters1一、液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培育基
酪蛋白胰酶消化物--------------------5.0g
乳糖--------------------------------4.0g
磷酸钠-----------------------------10.0g
亚硒酸钠----------------------------4.0g
L-胱氨酸
水--------------------------------1000mL电脑培训
终pH：±
混匀后加热得均匀溶液。在流动蒸汽中加热15分钟，不可灭菌。
1二、液体连四硫酸盐培育基（四硫磺酸钠亮绿TTB）
酪蛋白胰酶消化物--------------------2.5g
动物组织胃蛋白酶消化物--------------2.5g
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牛胆盐Bile Salts--------------------1.0g
碳酸钙------------------------------10.0g
硫代硫酸钠--------------------------30.0g
水---------------------------------1000mL
煮沸溶液使固体物质溶解。利用当天加入5g碘化钾和6g碘到20mL水中配制成的溶液，然后加10mL亮绿（1:1000），混匀。加入亮绿后的溶液不可加热。ladykillers
13、亮绿琼脂培育基
酵母膏------------------------------3.0g珠宝设计培训
动物组织胃蛋白酶消化物--------------5.0g
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