第27卷 第3期 中 国 乳 品 工 业V ol127,N o13 1999年 6月 CHI NA DAIRY I NDUSTRY June1999
乳酸菌增菌培养基的优化设计
The Design of Orthogonality Test Optimizing of Enrichment
Medium of Lactic Acid B acteria
吕加平Lu Jiaping
梁占东
Liang Zhandong
(东北农业大学・哈尔滨150030) (黑龙江省粮油食品贸易公司) (N ortheast Agricultural University)(Heilongjiang Provincial G rain and Oil T rade C o.)
骆承庠
Luo Chengxiang
郭彦友
G uo Y any ou
(东北农业大学・哈尔滨150030) (黑龙江味全乳品公司・安达151401) (N ortheast Agricultural University)(Heilongjiang Wei Quan Dairy C om pany)
摘 要：采用有交互作用正交试验优化设计了乳酸菌(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)增菌液，结果表明，对嗜热链球菌宜采用酪蛋白水解物、乳糖、番茄汁、β-磷酸甘油二钠，而保加利亚乳杆菌则宜采用鱼肉蛋白胨、乳糖、酵母浸膏、K2HP O4-K H2P O4，在37℃下培养24h后菌落总数分别可达5.76×109 cfu/ml和4.69×108cfu/ml。
儿童节快乐英语怎么说关键词：乳酸菌；增菌液；正交试验
Abstract:T he orth og onality test ud to design the opti2 mum enrichment br oth of lactic acid bacteria(streptococ2 cus therm ophilus(ST-1)and lactobacilus bulgaricus (LB-1)).T he best enrichment br oth for ST-1consist of cain hydr olysate lacto、tomato juice,β-glyc2 er oph osphate dis odium,and the optimum enrichment br oth for LB-1consist of peptone(fish powder)、lacto、K2 HP O4-K H2P O4、yeast extract.T w o enrichment medium in oculated with ST-1and L
B-1cultivated at37℃24 h,and the viable counts were5.76×109c fu/m l and4.69×108c fu/m l,res pectively.
K ey w ords:orth og onality test;enrichment medium;lac2 tic acid bacteria
收稿日期 1999—03—18
吕加平 男,35岁，教授，从事食品微生物学与乳品工艺学的教学与科研工作.
0 引 言
乳酸菌分离培养及其酶学研究、乳酸菌发酵剂的制备等都需要有良好的增菌培养基，使乳酸菌得以大量增殖，从而使乳酸菌在经过喷雾干燥、冷冻、冻干等处理后有足够的活菌数残存。增菌培养基大致分为配制培养基、乳基质培养基和乳清基质培养基，而后两者因其增殖慢，或不易分离菌体而不宜采用，或常常又配合以其他生长因子方可使用。另外，据培养基pH值的调控方式又可分为内外控型增菌液；外控型因需要专用的自动控制发酵罐而受到限制，而内控型则是将适宜的缓冲盐类加于培养基中使用。本研究拟采用正交设计，选取了常用的碳源、氮源以及缓冲盐类来优化设计保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的增菌液配方，便于两菌的增殖及制备发酵剂。
1 材料与方法
1.1 材 料
氮源材料：鱼肉蛋白胨，胰蛋白胨，酪蛋白水解胨，牛肉浸膏，酵母粉，均为生化试剂级。
proxyrver 碳源材料：乳糖、蔗糖、葡萄糖为分析纯。intuition
维生素、核苷酸等营养素源：西红柿汁，酵母粉，牛肉浸膏。
缓冲盐类:K2HPO4、K H2PO4、柠檬酸三钠、乙酸钠、β-磷酸甘油二钠等均为分析纯试剂。
天然原料：乳清粉购于北京中牧集团，脱脂粉为新西兰进口粉。
蛋白酶：胃蛋白酶。
753紫外-可见分光光度计：上海分析仪器厂生产。
1.2 方 法
1.2.1 试验设计
考虑到培养基碳源、氮源及其他营养成分之间可能存在联合协同的交互作用，因而，采用正交试验法，具体因素水平项目设计如表1所示。
表1 正交试验设计的因素水平项目(配制200ml)
水平因素A
(1g)因素B
(2g)因素C因素D
1鱼肉蛋白胨乳糖番茄汁(20ml)K2HPO4、KH2PO4 (各0.5g)
2胰蛋白胨蔗糖牛肉浸膏(1g)β-磷酸甘油二钠
(1g)
3酪蛋白水解物葡萄糖酵母浸膏(1g)柠檬酸三钠、乙酸钠
(各0.5g)
考虑到D因素与其他3个因素间的差别大，因此可将其与其他因素的交互作用忽略不计，而作为误差项用以评价其他因素项的可靠性。
菌体生长的测定：采用分光光度计于600nm处测定菌液的吸光度。
增菌液的配制：配制27种增菌液。培养液先经加热煮沸以沉淀部分不溶蛋白，经滤纸过滤，使增菌液呈完全澄清透明，以便于比色，增菌液经105℃灭菌15min。
菌体培养：将活化三代的ST-1与LB-1两菌(于M17和MRS分别活化)，按1%接种量接种于27种增菌液中，以灭菌方法分装5瓶，于37℃下培养, 24h后测定OD值与pH值。
2 结果与讨论
2.1 嗜热链球菌(ST-1)增菌培养基的优化配方设
计
具体正交试验结果与方差分析见表2、表3。
从表2与表3试验结果可以看出:A,B,C,D 四因素的交互作用不显著，而不同的因素水平，即不同种类的碳、氮及微量营养素源，对嗜热链球菌ST -1增菌效果的影响极显著(除C因素外)；各因素对ST-1增菌效果的影响大小顺序依次为:B→A→D→C;C因素对ST-1增菌的影响不显著，那么试验结果优化的最佳增菌培养基配方应为A3B1C1 D2，即酪蛋白水解物(0.5%)，乳糖(1%)，番茄汁(10%),β-磷酸甘油二钠(0.5%),pH值调节为6.6～7.0为宜。从正交试验表的结果来看，试验9、20、21的吸光度值均呈较高水平。另外，按最佳水平配制的增菌液在接种活化二代的ST-1(0.5%接种量)，在培养24h后，菌落总
数可达5.76×109 cfu/ml，比M17和番茄汁增菌液(按同样方式接种ST -1)的增菌数均高，后两者的菌落总数为2.4×108和3.75×108(测定结果均为平均值)。这一结果表明，通过正交试验优选的配方是吸取了M17与番茄汁培养基两者的优势影响因素组合而成。
表2 ST-1与LB-1增菌液正交试验试验号ST-1LB-1试验号ST-1LB-1
10.3650.52150.1800.07
20.4100.57160.2000.07
30.3370.47170.2250.08
40.4200.34180.1250.24
50.2100.03190.4300.28
60.2550.04200.4900.465
70.2050.19210.6000.25
80.1150.145220.2280.25
90.2400.345230.3950
100.3800.045240.3350.025
110.1900250.3750.35
120.1900.3260.1000.19
130.2150270.2480.45
140.1400.075
2.2 保加利亚乳杆菌(LB-1)增菌培养基的优化配
方设计
具体正交试验方案与方差分析见表2和表4。 从表2和表4试验结果的统计分析数据可见: A,B,C,D四因素之间的交互作用不显著，各因素对LB-1增菌效果影响大小顺序依次为B→A→D →C，与前述ST-1的相同;C因素对LB-1增菌的影响不显著，但在实际应用中，酵母浸出物与牛肉膏对乳酸菌还是有显著的增菌效果，而本试验统计结果出现不显著，可能在试验中A,B,C三因素之间可能存在交互作用(因A,B作用显著，而掩蔽了C因素的作用)，因为按极差分析C因素的影响是
31
1999年6月 乳酸菌增菌培养基的优化设计
显著的，因此，在设计配方时不宜将C因素去掉；由试验结果优化的最佳增菌培养基配方应为A1B1C3 D1，按此组合配制的增菌液接种活化两代的LB-1菌后的增菌效果尚可(菌落总数为4.60×108)，但不如ST-1增菌液对ST-1的增菌效果；与MRS和番茄汁、乳清培养基、麦芽汁培养基、酶解乳清培养基的比较发现，最佳配方的增菌效果与MRS的增菌效果相近，因此，在实验应用中，还应加入微量Mn与Mg来促进其生长，实验结果也表明这一点。具体比较试验见表5，试验的最佳配方与相关培养基相比在配制方法、原料价格方面还是有一定优势。应用中可将缓冲盐、微量盐MgS O4、MnS O4配制成盐贮备溶液，用时按量加入盐溶液即可，缩短了配制时间。
表3 方差分析(Ⅰ)
方差来源变差平方和自由度方差估计值F值F0.05(f1,f2)显著性最佳水平A0.1022382 0.05111922.86185.1433A3 B0.1391012 0.06955131.10515.1433B1 C0.0164802 0.008243.68525.14 C1 D0.0798962 0.03994817.86585.1433D2
A×B0.0345774 0.0086443.86585.14
A×C0.0184784 0.00461952.06595.14
B×C0.0065764 0.0016440.73525.14
试验误差0.0134176 0.002236
总和0.41076326文案翻译
表4 方差分析(Ⅱ)[3,4]
方差来源变差平方和自由度方差估计值F值F0.05(f1,f2)显著性最佳水平A 0.1921972 0.096098513.7455.1433A1 B 0.2408672 0.120433517.2255.1433B1 C 0.024602 0.01231.75925.14 C3 D 0.0952392 0.04761956.810765.143D1
A×B 0.1259644 0.0314914.503995.14
A×C 0.0505544 0.01263851.807625.14
begin什么意思B×C 0.0990744 0.02476853.54255.14
试验误差 0.0419516 0.0069918
总和 0.87044626
LB-1最佳设计配方与其他培养基的比较如表5所示。表5中，酶解乳清培养基:7.5%乳清，用磷酸5m ol/dm3(5N)调pH值至3，加入0.1%胃蛋白酶,37℃下反应45min，再用5m ol/dm3(5N)氨水调pH值至7，然后加入0.2%酵母粉，灭菌备用。麦芽汁培养基：麦芽汁1000ml，蛋白胨3g，乳糖5g, CaC O35g。
乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂，影响生长的因素多，在实际工作中还应做其他条件的优化，如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等，因工作量大而时间有限，只能对配方作初步的优化设计。为了降低生产成本，在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解，用以提高增菌效果，再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物，在发酵罐内完成乳酸菌的增菌，罐内可以通入过滤除菌的N2和C O2，以降低反应液氧化还原电势(特别是保加利亚乳杆菌)。若有自动化发酵罐还可通过监测pH值，发酵罐自动注入灭菌的1m ol-1NaOH或NH4OH液，以中和代谢乳酸。
表5 LB-1最佳设计配方与其他培养基的比较
培养基
(M edium)pH值
3菌落总数33
(cfu/m l)
最佳配方 6.6 4.67×108
MRS[3～4] 6.6 3.86×108
番茄汁培养基[3～4] 6.6 6.4×107
乳清培养基[3～4] 6.6 5.3×107
酶解乳清培养基 6.6 2.53×108
麦芽汁培养基 6.6 2.5×106
注:3pH值用HCl的浓度为1m ol/dm3(1N)和NaOH的浓度为1 m ol/dm3(1N)调整，酸度计测定;33菌落总数为两个样测
定的平均值
41 中 国 乳 品 工 业 第27卷第3期
3 结 论
采用正交试验设计优化乳酸菌增菌液配方是简便有效的试验方法。结果表明:A,B,C,D四因素间交互作用不显著，对增菌液吸光度影响的大小顺次为B→A→D→C；嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌增菌液最佳配方分别为A3B1C1D2和A1B1C3D1；按此配方设计的增菌液接种ST-1与LB-1菌,37℃下培养24h后，菌落总数分别可达到5.76×109cfu/ ml和4.69×108cfu/ml。
参考文献
1 徐中儒.农业试验最优回归设计.北京：农业出版社,1988 2 贵州农学院.生物统计附试验设计.北京：农业出版社, 1983
3 K laenhammer T R.M icrobiological considerations in lection and preparation of lactobacillus strains for u as dietary ad2 juncts.J.Dairy Sci.,1982,65:1339～1349
4 Meijer W C,et al.Determination of growth param oters of lacto2 cocci in milk and ultrafiltered milk.J Dairy Sci.,1995,78:17～23
愿你在此5 国际乳品联合会标准(I DF117:1983).酸奶特征微生物的菌落计数.中国乳品工业,1990,18(4):178～182,191
(上接第7页)eif
3 结 论
烟台家教 (1)G8菌株在发酵约14h，对数末期-稳定前期细菌素活性最高；随着发酵时间的不断延长，活性在缓慢地下降，同时还可以看出其活性高峰表现在4.0～5.0的pH值范围。
(2)碳源和氮源对G8菌株细菌素的产生有明显的影响，而不同碳源对G8菌株细菌素的产生无显著差异，葡萄糖相对较好；不同氮源对其细菌素的产生有显著的差异，其中蛋白胨明显优于氨基酸。
(3)四因素三水平的正交试验证明，在保证试验菌正常生长情况下，起始pH值和培养温度对G8菌株细菌素的产生有明显的影响，而葡萄糖和蛋白胨的含量影响相对较小。筛选出产细菌素的最优水平组合为C2D2A1B2，即起始pH值为6.0；培养温度为30℃；葡萄糖含量为0.5%；蛋白胨含量为1%。comres
参考文献
1 Lindgren S W,D obrogsz W J.Antag onistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentation.FE MS M icrobiol.
Rev.,1990,87:149～164
我心永恒英文
2 K laenhammer T R.Bacteriocins of lactic acid bacteria.
Biochimie,1988,70:337～349
3 Dallas G H oover,Larry R S teens on.Bacteriocins of lactic acid bacteria.F ood Science and T echnology International Serics,1995
51
1999年6月 乳酸菌增菌培养基的优化设计
