分子植物育种，2010年，第8卷，第5期，第891－898页Molecular Plant Breeding,2010,Vol.8,No.5,891－898
研究报告A Letter
棉花耐盐性的SSR 鉴定研究
张丽娜叶武威*王俊娟樊保香
中国农业科学院棉花研究所，农业部棉花遗传改良重点实验室，安阳,455000*通讯作者,;
摘要土壤盐碱化现已成为危害农业发展和生态环境的全球性问题，培育和鉴选棉花耐盐品种是合理
开发利用盐碱地的有效途径。本研究选用25份耐盐(包括耐和抗)和23份盐敏感棉花种质为实验材料，采用SSR 技术，
展开了棉花耐盐性鉴定技术的有关研究。从DNA 快速提取到PCR 扩增和产物检测以及多标记组合鉴定等环节进行分析探讨，初步制定了一套适于棉花耐盐性分子鉴定的方法，即多标记组合鉴定法。并用11份材料对该方法进行了验证，结果表明和0.4%盐量胁迫法的鉴定结果的相符率达90.91%。初步研究结果表明多标记组合鉴定法可用于棉花耐盐分子标记辅助鉴定。
关键词棉花，耐盐,SSR，标记组合
Identification of Salinity-tolerance on Cotton by SSR Markers
Zhang Lina Ye Wuwei *Wang Junjuan Fan Baoxiang
Cotton Rearch Institute,Chine Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement,Ministry of Agriculture,Anyang,455000
*Corresponding author,; DOI:10.3969/mpb.008.000891
Abstract Soil salinization has become a rious global problem affecting the agricultural development and the e-cological environment.It is an effective way to farm saline land and to enhance the sustainable agricultural devel-opment by developing,identifying and screening the salinity tolerant varieties of cotton.25salinity tolerant and 23salinity nsitive cotton accessions were ud in this study to identify salinity tolerance of cotton by SSR markers.A new t of preliminary methods system,called SSR multi-markers salinity-identification method,was initially established to identify salinity tolerance of cotton by the standardization of the whole process of DNA extraction,PCR amplification,amplification products detecting,and marker-combination.Another 11ma
terials were ud to testify this method,which showed the coincidence of 90.91%in consistence with the identification result of 0.4%NaCl identification method,which showed that the multi-markers identification method was proved to be ud to identify the salinity tolerance of cotton germplasm.Keywords
Cotton,Salinity tolerance,SSR,Multi-markers
基金项目：本研究由转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08005－004)和“十一五”国家科技支撑计划(2006BAD13B04－1)共同资助。
棉花作为我国主要的经济作物，在国民经济发展中占有举足轻重的地位。由于粮棉争地矛盾突出，棉花的生产受到严重影响。由于棉花本身具有耐盐碱特性，可作为改良利用盐碱土、发展盐碱地区经济的先锋作物(辛承松,2000；陈秀兰,1998)。评价和鉴选耐盐种质是耐盐育种的前提，目前的棉花耐盐性
鉴定方法大都建立在形态学的基础上，工作量大，成本高，
且受生长季节的限制。分子标记的出现给耐盐性研究带来新思路和新方法。在大豆上，郭蓓等(2000;2
002)利用改良的群分法BSA (bulk gregant analysis)，筛选到一个与大豆耐盐基因紧密连锁的PCR 标记，并在不同组合的F 2分离群体及耐盐性不
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
同的大豆品种中得到验证。在小麦上，单雷等(2006)和刘旭等(2001)采用SSR技术结合BSA方法分别在小麦中发现与耐盐性状连锁的SSR标记并对其中的耐盐相关基因进行了定位；索广力等(2001)以耐盐性差的“冀麦24”和其经正定霉素诱变后得到的耐盐突变体8901－17为材料，筛选到一个与小麦耐盐突变位点紧密连锁的RAPD标记；翁跃进(1999)利用BSA法筛选到一个与茶淀红麦耐盐基因有关的RFLP标记，后来他们采用BSA法筛选到一个与茶淀红耐盐基因连锁的RAPD标记OPZ09，并对该标记进行了克隆(翁跃进和陈道明,2002)。杨青川和韩建国(2005)利用改良的BSA法结合RAPD技术筛选到一个与苜蓿耐盐基因连锁的分子标记。Abdel等(1997)利用BSA法检测到与玉米自交系耐盐性有关的RAPD标记。
以微卫星序列为基础的SSR标记具有操作简单，重复性好；数量丰富，揭示的多态性高；呈共显性遗传；检测成本低等优点，是一种极具实用价值的分子标记(赵海燕等,2009)，因而广泛应用于生物遗传图谱构建、种质鉴定、基因定位和遗传多样性分析等方面，由于其巨大的应用潜力，棉花SSR引物的
开发正在快速进行，这为利用SSR技术进行棉花耐盐性研究奠定了良好的基础。
本研究旨在从DNA水平出发，利用SSR技术，寻找与棉花耐盐性有关的标记，并采用多标记组合法对棉花耐盐性进行鉴定，同时通过大田鉴定来验证分子鉴定结果的可靠性，从而初步建立一种可以快速准确进行棉花耐盐性鉴定的方法，提高棉花耐盐种质筛选效率，加快棉花耐盐育种进程，为棉花耐盐基因的挖掘、克隆及分子标记辅助育种等提供信息参考。
1结果与分析
1.1棉花耐盐性的盐池鉴定结果
48份种质的盐池鉴定结果见表1，各个材料的耐盐性相对成活苗率(SRI)处于22.07%~77.35%之间。从表中可以看出耐盐材料(包括耐和抗的级别)有25份，占供试材料的52.08%，其中耐盐级别达到抗的材料只有4份，分别是CT114、CT115、CT06、CT05，均为我们实验室自主选育的材料，占耐盐材料的16%。23份盐敏感材料中大部分是当前各棉区的主栽品种。
1.2耐盐相关标记筛选
首先选用4个典型材料(耐盐材料中9835和中
DOI:10.3969/mpb.008.000891
07，盐敏感材料中S9612和新研96－48)进行SSR引物的筛选。最终从5053对SSR引物中初步筛选出246对多态性引物，占6.21%。然后又新增2个材料(耐盐材料中9806和盐敏感材料鲁棉研16)对初步筛选出的246对SSR引物进行复筛，从中挑选95对差异明显、带型清晰、易于辨认的引物对48份种质资源进行PCR扩增。
通过仔细观察分析95对SSR引物对48份供试材料的扩增图谱，发现有5个标记：Y270、Y152、Y159、Y190、Y220，在多数耐盐材料中扩增出在盐敏感材料中没有的特异性片段；1个标记：Y258，在多数盐敏感材料中扩增出在耐盐材料中没有的特异性片段。将这6个标记称为耐盐相关标记，将相应的特征带称为耐盐带(记为T)和敏盐带(记为S)。图1为6个耐盐相关标记对48份材料的扩增图谱，图中标出了相应的特征带位置。
将分子标记鉴定结果与盐池鉴定结果相比对，
图1Y152,Y220,Y270,Y159,Y190和Y258对48份种质资源的扩增图谱
注：从1至48顺序对应表1
Figure1DNA fragments amplification of Y152,Y220,Y270, Y159,Y190and Y258in48accessions
Note:The number from1to48is the same as that in table 1
892
棉花耐盐性的SSR鉴定研究
Identification of Salinity-tolerance on Cotton by SSR Markers
表148份供试材料的的名称、来源及耐盐性鉴定结果
Table1Names,sources and salinity tolerance of48cotton materials
编号Coding No. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10新概念英语课文下载
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24品系名
Accession
中9409
Zhong9409
中9806
Zhong9806
中07
Zhong07
CT114
CT115
CT06
CT02
CT05
CT186
CT5－10
中植棉8号
Zhongzhimian8
CT637
邯109
Han109
豫2067
Yu2067
ZH－1
CT1－1
CT03
CT04
新陆早12号
Xinluzao12
CT924
新陆早36号
Xinluzao36
新陆早19
Xinluzao19
CT01
抗病164
Kangbing164
来源
Sources
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
河北
Hebei
中棉所
CCRI
河北
Hebei
河南
Henan
中棉所圣诞的英文
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
新疆
Xinjiang
中棉所
CCRI
新疆
Xinjiang
新疆
Xinjiang
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
SRI
(%)
54.94
51.43
58.37
77.35
76.15
75.00
65.47
75.80
65.64
61.86
67.50
57.88
66.38
64.60
58.37
61.01
53.91
58.33
52.56
55.41
51.16
55.09
54.21
55.29
耐盐级别
Salinity tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
抗
Salt-resistance
抗
Salt-resistance
抗
Salt-resistance
耐
Salinity-tolerance
抗
Salt-resistance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
耐
Salinity-tolerance
编号
Coding No.
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
snowy是什么意思中文40
41
42
43
44
45
46
47
48
品系名
Accession
新疆－2
Xinjiang－2
邯177
Han177
Cap500
丰抗棉1号
Fengkangmian1
邯棉103
Hanmian103
快丰868
Kuaifeng868
银山6号
Yinshan6
冀丰106
Jifeng106
邯5158
Han5158
鑫秋1号
Xinqiu1
新陆中26
Xinluzhong26
新陆早33号
Xinluzao33
国欣棉11号
口头表达能力Guoxinmian11
colinGK50
银瑞361
Yinrui361
鲁棉研27
SCRC27
鲁棉研21
SCRC21
鲁棉研17
SCRC17
鲁棉研16
SCRC16
中棉所45
CCRI45
中棉所49
CCRI49
中选41
Zhongxuan41
中S9612
ZhongS9612
新研96－48
Xinyan96－48
来源
Sources
新疆
Xinjiang
河北
Hebei
中棉所
CCRI
河北
Hebei
ranknow
河北
Hebei
河北
Hebei
河南
Henan
河北
Hebei
河北
Hebei
山东
Shandong
新疆
Xinjiang
新疆
Xinjiang
河北
Hebei
河北
狼子野心翻译
Hebei
山东
Shandong
山东
Shandong
山东
Shandong
山东
Shandong
山东
Shandong
河南
Henan
河南
oprah winfrey
Henan
中棉所
CCRI
中棉所
CCRI
河南
Henan
SRI
(%)
22.07
29.73
34.15
45.30
37.22
40.62
45.00
41.91
36.57
40.32
43.78
45.99
45.00
38.69
36.03
faraway
45.00
40.62
38.89
46.12
49.13
48.89
53.52
41.60
34.91
耐盐级别
Salinity tolerance
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
耐
Salinity-tolerance
不耐
Salinity-nsitive
不耐
Salinity-nsitive
893
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
若盐池鉴定为耐盐(或盐敏感)的材料扩增出耐盐特征带T(或敏盐特征带S)，则视为两种鉴定结果相符。6个标记的鉴定结果与盐池鉴定相符程度在62.50%~72.92%之间，相符率最高的标记是Y190，为72.92%(表2)。
表248份棉花种质资源的SSR鉴定结果
Table2Identification of salinity tolerance among48cotton ac-cessions by SSR identification
和盐池鉴定结果的相符率(%) Consistent percent-age compared to the identification result of salt garden(%)
SSR鉴定
SSR identification
Y270
62.50
Y152
66.67
Y159
62.50
Y190
72.92
Y220
66.67
Y258
70.83
1.3标记组合法鉴定棉花耐盐性
由于单标记鉴定和盐池鉴定结果的相符率偏低，故此采用标记组合法鉴定棉花耐盐性。标记组合有两种方式，一是多重PCR技术，是指将两对以上的引物放在同一反应体系中进行PCR扩增(马雪霞等,2007)；再一种是单一PCR扩增后进行标记组合，其中又包括扩增后多重检测(是指将两对以上的SSR单一引物扩增产物进行混合，然后电泳检测)和单一引物扩增检测后组合。由于多重PCR技术和扩增后多重检测技术都需要考虑到扩增片段的大小，扩增片段太接近的引物不宜组合，此外多重PCR技术还需考虑各引物的退火温度不宜差别太大，而且各引物之间还可能会产生干扰。鉴于此，本实验采
用单一引物扩增检测后再组合的方式对棉花耐盐性进行鉴定，标记组合方式及与盐池鉴定的比对结果见表3。综合考虑各种标记组合的鉴定效率，认为Y190(T4)、Y159(T3A和T3B)和Y258(S1)三标记组合鉴定棉花耐盐性最为经济有效，鉴定结果与盐池鉴定的相符率可达到87.50%，是相符率最高的一种标记组合方式。
1.4标记组合鉴定法的验证
用11份材料(J1~J11)验证该组合鉴定法。每份材料提取15个单株的DNA。首先随机选取每份材料的1个单株的DNA，然后以此为模板进行SSR-PCR扩增和扩增产物的检测，检测图谱如图2所示。按照Y190(T4)、Y159(T3A和T3B)和Y258(S1)三标记组合的判断标准：扩增产物有耐盐特征带T且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T无S1，判断为盐敏感株。11份材料的标记组合鉴定结果以及和盐池鉴定结果的比较见表4，结果表明11份材料中有8份是和盐池鉴定结果吻合的，吻合率达72.73%。
由于棉花属于常异花授粉作物，本身存在一定的天然异交率，种子纯度难以保证，而SSR标记十分灵敏，可以检测到品种内的微小变异。针对这种情况，提出对某个品种的多个单株进行耐盐性分子鉴定，用群体的检测结果来代表该品种的鉴定结果。理论上讲，进行耐盐性分子鉴定时每个品种提供的单株数越多，鉴定结果越可靠。兼顾到经济高效、操作简便的原则，本研究中每个供鉴品种提取15个单株的DNA，以这15个单株DNA的检测结果来代表该品种的鉴定结果。图3和图4为Y190、Y159和Y2
58三标记对J7和J8的15个单株的扩增图谱。图3表明在J7的15个单株中有13个是盐敏感的，故判断J7为盐敏感材料。图4表明在J8的15个单株中有11个是盐敏感的，故判断J8为盐敏感材料。将11份材料的单株分子鉴定结果和群体分子鉴定结果与盐池鉴定结果比较(表5)，11份材料的群体分子鉴定结果中有10份是和盐池鉴定结果吻合的，吻合率达90.91%，相比单株分子鉴定结果(吻合率为72.73%)准确性有了很大提高。
图2Y190、Y159、Y258对11份鉴定材料的扩增图谱
注:“√”标出了耐盐和敏盐特征带
Figure2DNA fragments amplied by Y190,Y159and Y258in11 materials
Note:“√”markers of salinity-tolerant and salinity-nsitive characteristic bands
DOI:10.3969/mpb.008.000891
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表4标记组合法和盐池鉴定法鉴定棉花耐盐性的比较结果
Table 4Comparison on identification of salinity tolerance by markers-combination and salt garden 表3标记组合法鉴定棉花耐盐性的结果
Table 3Identification of salinity tolerance by SSR markers-combination method 类型Styles 两标记Two markers
三标记Three markers
四标记Four markers
五标记Five markers
标记组合方式Multi-markers Y190,Y258
Y220,Y258Y152,Y258Y159,Y258
Y190,Y220,Y152Y190,Y159,Y220Y190,Y159,Y258Y190,Y220,Y258
Y190,Y159,Y152,Y220Y190,Y220,Y152,Y258Y190,Y159,Y220,Y258
Y190,Y159,Y152,Y220,Y258判断依据
Judgement basis 有T 无S 为耐
Salt-tolerant with bands “T ”instead of “S ”有T 无S 为耐
Salt-tolerant with bands “T ”instead of “S ”有T 无S 为耐
Salt-tolerant with bands “T ”instead of “S ”有T 无S 为耐
Salt-tolerant with bands “T ”instead of “S ”至少2T 为耐
Salt-tolerant with at least two bands “T ”至少2T 为耐
Salt-tolerant with at least two bands “T ”有T 无S 为耐
Salt-tolerant with bands “T ”instead of “S ”有T 无S 为耐
Salt-tolerant with bands “T ”instead of “S ”至少2T 为耐
Salt-tolerant with at least two bands “T ”至少2T 且无S 为耐
Salt-tolerant with at least two bands “T ”instead of “S ”
至少2T 且无S 为耐
Salt-tolerant with at least two bands “T ”instead of “S ”
至少2T 且无S 为耐
Salt-tolerant with at least two bands “T ”instead of “S ”
和盐池鉴定结果的相符率(%)
Consistent percentage compared to the identification result of salt garden (%)
77.08
72.92
70.8370.8379.1775.0087.5083.3377.0883.3379.1783.33项目Stems HAU1918(T4)HAU1058(T3)TMB1288(S1)
分子鉴定结果Identification result of SSR markers 盐池鉴定结果Identification result of salt garden
J1T4
T T J2S T J3S1
S S
J4T4T
T
J5T4
S1S
S
J6S1S
S
J7T4
T
S
J8S
T J9T2
T T J10T4
T
T
J11
S
S
注:T 表示耐盐;S 表示盐敏感
Note:T is salinity-tolerance;S is salinity-nsitive
注:T 表示耐盐;S 表示盐敏感
Note:T is salinity-tolerance;S is salinityt-nsitive
表5单株分子鉴定、群体分子鉴定和盐池鉴定法鉴定棉花耐盐性的比较结果
Table 5Comparison on identification of salinity tolerance by in-dividual plant,population and salt garden 项目Stems
单株鉴定结果
Identification
result of individual plant
群体鉴定结果
Identification result of group
盐池鉴定结果
Identification
result of salt garden
laboratories
J1T T T J2S T T J3S S S J4T T T J5S S S J6S S S J7T S S J8S S T J9T T T J10T T T J11
S
S
S
棉花耐盐性的SSR 鉴定研究
Identification of Salinity-tolerance on Cotton by SSR Markers
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding 图3Y190,Y159和Y258对J7的15个单株的扩增图谱
注:“√”标出了耐盐特征带
Figure 3DNA fragments amplification of Y190,Y159and Y258with 15individual plants of J7Note:“√”markers of salinity-tolerant characteristic bands
图4Y190,Y159和Y258对J8的15个单株的扩增图谱注:“√”标出了耐盐和敏盐特征带
Figure 4DNA fragments amplification of Y190,Y159and Y258with 15individual plants of J8
Note:
“√”markers of salinity-tolerant and salinity-nsitive char-acteristic bands
1.5棉花耐盐性分子鉴定方法的初步建立
通过前文对标记组合方式的分析和比较，基于SSR 标记技术，初步建立了一套可用于棉花耐盐性分子鉴定的方法，操作程序如下：
(1)棉花育苗。随机选取约30粒供鉴材料的种子，
均匀撒播于装有普通大田土壤或高温灭菌过的沙质的发芽盒中，然后置于30℃左右的光照培养箱中发芽。播种前，棉种最好用清水浸泡一天，可促使棉种吸水提早萌发。
(2)棉花基因组DNA 提取。待棉苗长出子叶后，对每个材料的单株分别取2片子叶，装入预先放有1粒小钢珠的2mL 离心管。采用改良的CTAB 法结合自动磨样机快速磨样，提取每个单株的基因组DNA 。由于SSR 标记对模板DNA 的纯度要求不高，所以不需纯化DNA 即可直接进行SSR-PCR 扩增。
(3)SSR-PCR 扩增和产物检测。由于SSR 标记对模板DNA 用量要求不高，陈勋基等(2008)报道模板浓度为4~12ng/μL 时均扩增出条带；陈浩东等
(2007)的研究表明，模板浓度为1~5ng/μL 时均扩增出清晰的条带。因此在进行大批量棉种检测时不需测DNA 浓度。DNA 风干后，用200μL 1×TE (pH 值8.0)或灭菌的双蒸水溶解DNA ，然后取少量的DNA 原液，稀释5倍后，用作PCR 扩增的模板。可根据PCR 扩增效果再对模板浓度进行调整。引物分别为：Y190、Y159和Y258，PCR 反应程序为3.3SSR 标记
分析中所述。PCR 扩增产物的检测采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染显色(潘兆娥等,2008)。
(4)标记组合鉴定。采用Y190(T4)、Y159(T3A 和T3B)和Y258(S1)三标记组合鉴定，判断标准为：扩增产物经检测有耐盐特征带T 且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T 无S1，判断为盐敏感株。特征带T4、T3A 和T3B 、S1的位置如图1中所示。
A 、对于棉花普通常规种和杂交种，采用供鉴材料15个单株DNA 的检测结果来代替耐盐性的分子鉴定。
B 、对于纯度较高的多年自交种，则可将单株DNA 的数目降到10个。
C 、对于纯度较差的品种，则需增加单株DNA 的数目。
(4)若供鉴材料为单株或F 2、F 3等分离群体，则直接以每个单株DNA 的鉴定结果来代表该单株的耐盐性。
2讨论
2.1标记组合鉴定法的有效性
由于SSR 标记对模板DNA 需求量很少而且对DNA 纯度要求也不高，通常情况下不需纯化DNA 即可直接进行PCR 扩增。在30℃条件下，仅需3d
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