李氏杆菌生物学特性鉴定及平板凝集快速诊断方法的建立

更新时间:2023-07-19 09:39:52 阅读：评论：0

余复昌

（2010届动物检疫专业1班）

摘要：李氏杆菌病是一种由单核球增多性李氏杆菌(Listeria Monocytogenes , LM) 所致的传染病，主要表现为脑炎。这种菌可以感染除牛以外的绵羊、山羊、猪、各种实验动物等约50余种的动物，人亦可感染,能导致孕妇、新生儿及免疫力低下的成人发病。本试验对实验室保存的分离菌株进行形态学特性、培养特性和生化特性鉴定，结果与李氏杆菌的生物学特性一致，初步确定分离菌株为李氏杆菌。本试验对分离菌进行了抗药性试验，结果显示该分离菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素高度敏感，对头孢唑啉、左氧氟沙星和多粘菌素中度敏感；对头孢他啶、头孢呋辛钠耐药性较强。本试验通过用甲醛灭活苗免疫试验动物制备特异性抗体，将特异性抗体与抗原做平板凝集试验，建立一种快速准确检测李氏杆菌病的方法，该方法具有简便、快速的特性。

关键词：李氏杆菌；平板凝集；血清；特异性

The Biology Characteristic Appraisal of Listeria Monocytogenes and an Establishment of Plate Agglutination Fast Diagnostic Technique

Yu Fuchang

(Class 1 of Animal Quarantine, Graduated in 2010)

Abstract: Objective: The Listeriosis is an Infectious dia caud by Listeria Monocytogenes (LM); the main performance is the encephalitis. This kind of fungus may infect many kinds of experimental animals include the sheep, the goat, the pig and so on, except the cow, approximately 50 kinds of animal. It also may infect the human, and cau the pregnant woman, the newborn and the low-immunity adult’s incidence. This experiment carries on the morphology characteristic, the rai characteristic and the biochemistry characteristic appraisal to the laboratory prervation's paration strain, the result is consistent with the LM’s biology characteristic, the parated strain has been preliminarily determined to be the Listeria Monocytogenes. This experiment has carried on the antibiotic experiment to the isolate, The result demonstrated that this parated str

ain has a high nsitivity to Ampicillin, Gentamicin, Streptomycin, and a Moderate nsitivity to Cefazolin, Levofloxacin, Polymyxin, and a high drug tolerance to Ceftazidime, Cefuroxime Sodium. In this experiment, experimental animals were immune by the vaccine which was inactivated by formaldehyde, and specific antibody was made in this way. Then specific antibody and antigen was ud to make plate agglutination test, and a rapid and accurate detection of listeriosis was established; this method is simple, fast, and effective.

Key word: Listeria Monocytogenes; Plate agglutination; Blood rum; Specificity

李氏杆菌为两端钝圆、平直或弯曲的小杆菌，不能形成荚膜和芽孢，染色呈革兰氏阳性[1]。本菌为需氧及兼厌氧性菌，在pH 9. 6 需氧或微需氧条件下可迅速繁殖，而在厌氧和pH 5. 6 的条件下无法生长[2]。在普通培养基上能生长，在含血清或血液琼脂平板上生长良好，并形成狭窄的β溶血环，胰蛋白胨琼脂是用于保存培养该菌最好的培养基，可形成具有蓝绿色特殊光泽的纯净透明菌落[3 ]，在肝汤和肝汤琼脂上生长良好，呈圆形、光滑平坦，粘稠透明的菌落，折光观察，呈乳白黄色，在肉汤内微混浊，形成黄色颗粒[4,5,6]。

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李氏杆菌疾病是重要的人畜共患传染病之一，主要由单核细胞增多性李氏杆菌引起, 呈世界性分布[7]。自1926 年首次分离到本病原后，现已呈世界性分布，作为致病菌和腐生植物致病菌而广泛存在于环境中[8]。作为一种重要的人畜共患传染病，L M 也能导致孕妇、新生儿及免疫力低下的成人发病，这说明李氏杆菌对人类的健康构成极大的威胁[9]。

1 材料与方法

1.1试验时间和地点

于2010年3月～20120年5月，在河南农业大学牧医工程学院二楼微生物试验室进行。

1.2菌种来源

采用河南农业大学牧医工程学院微生物试验室保存的菌种，经分离纯化而成。

1.3试验动物foreigner怎么读

兔子一只，购自河南康达试验动物中心，品种为日本大耳白，无天然凝集素，且经各项体检级别为清洁级。

1.4培养基

主要用到以下几种培养基：改良马丁肉汤培养基、改良马丁肉汤琼脂平板、戊糖发酵管、硝酸盐试验培养基、甲基红试验培养基、VP试验培养基。各种培养基均按照产品说明书配制方法配制，pH均调至李氏杆菌的最佳生长pH：7.0～7.2。

1.5主要试验器材

本试验用到的主要试验器材有立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS、上海申安医疗器械厂）、电热恒温培养箱(上海跃进医疗机械厂)、净化无菌操作台（吴江市净化设配总厂）、台式封闭电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）、高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、一次性无菌使用注射器（河南圣光集团医用制品有限公司）、8孔玻璃板、冰箱等及其它微生物学试验常用仪器。

1.6病原菌的纯化

将试验室保存的菌种在改良马丁琼脂平板上划线，于37℃恒温培养箱中培养14 hbuddhism，然后挑取生长良好、边缘整齐的单个菌落接种于含5mL改良马丁肉汤的试管中，于while是什么意思37℃恒温培养

箱中培养约14 h，置4℃冰箱保存备用。

1.7 生物学特性鉴定

1.7.1生化特性鉴定用分离纯化的菌株涂片，染色镜检并做相关生化试验。本次生化试验包括：戊糖发酵试验、硝酸盐试验、甲基红、V-P试验等四类试验，将菌以各生化试验要求接种方法接种于各生化试验培养基，置37℃恒温培养箱培养18～20h后观察并记录结果。

1.7.2 抗药性鉴定将菌液均匀涂布于培养基表面，置37℃恒温培养箱培养18～20h后观察并记录结果，本次抗药性试验包括氨苄西林、庆大霉素、左氧氟沙星、多粘菌素、链霉素、头孢唑啉、头孢他啶、头孢呋辛钠等八种药敏试验。

1.8 高免血清的制备

1.8.1增菌培养吸取分离纯化过后的菌液10μL，接种于含50mL改良马丁肉汤的锥形瓶中，置37℃恒温培养箱中培养约14 h。

1.8.2菌落计数从增菌后的马丁肉汤中吸取1 mL菌液，十倍稀释至10-10，以10-5、10-6、

10-7、10-8、10-9等五个浓度做菌落计数，用以确定菌液中细菌的含量，并据此将菌液调节至40亿/mL。

灭活苗制备与免疫的具体方法如下：

1.8.3灭活抗原的制备在调节浓度后的菌液中加入一定量的甲醛溶液，使甲醛的最终含量为0.4%，灭活约24 h，期间每隔约2 h摇晃一次，以保证灭活完全。灭活后加入佐剂，除第一次加入的为弗氏完全佐剂外，其余均为弗氏不完全佐剂。加入佐剂后，应使灭活的菌液与佐剂充分混匀，最终形成“油包水”的结构。

1.8.4免疫试验动物按照0.5mL/Kg体重计算，给试验兔以背部皮下多点注射法第一次接种疫苗。以后每隔7~8 d进行下一次免疫，共免疫三次。

1.8.5免疫血清的收集采取心脏采血法，2.5kg家兔一次可取血20~30mL。取血完毕后马上将所采血液分装入2个无菌大试管内，斜放，待血液凝固后，置于37℃恒温箱中30min，使血清充分析出，吸取上清于干净离心管中，于5000rpm离心10min，再取上清液加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，测定抗血清的效价后，封好瓶口，贴好标签，

注明抗血清名称、效价及日期，置冰箱保存备用[10]。

1.9 平板凝集方法建立

1.9.1最佳凝集稀释度的测定抗原共制备成两个浓度，即原浓度和二倍浓度。先以原菌液nws10倍稀释至原浓度的10-10倍，取合适浓度做菌落计数以确定原菌液中菌体浓度。然后取原浓度菌液1mL以3000rpm的速度离心10min，弃去上清液，加生理盐水至0.5mL，即制成二倍浓度的抗原。取8孔玻璃板，用生理盐水倍比稀释抗体血清, 稀释成1:1、1:2、1:4、1:8共四个浓度梯度，从左至右依次加至各孔中。在两行孔中一行加二倍抗原，另一行加入原浓度抗原，在3～5min内读取结果。同时做阴性对照。凝集反应最好的稀释度即为最佳凝集稀释度。

1.9.2 判定标准按下列标准记录反应结果：

e mail地址出现“＋＋＋＋”，记为100% 凝集；出现“＋＋＋”，记为75% 凝集；出现“＋＋”，记为50% 凝集；出现“＋＋＋＋”，记为25% 凝集；以出现“＋＋＋＋”为阳性判断标准。

在阳性血清与凝集抗原出现明显凝集颗粒，阴性血清与凝集抗原之间仍均匀浑浊的前提下，阳性血清与待检抗原出现明显凝集颗粒，则判为阳性，如均匀浑浊，则判为阴性，介于二者之间，则判为可疑。

1.9.3 特异性试验

以副溶血弧菌为抗原，浓度为最高抗原凝集浓度，用已免疫血清做抗体，以最佳抗体凝集浓度做平板凝集试验，在3min内观察并记录试验结果。

2 结果与分析

删除英文2.1病原菌分离纯化结果

试管内容物变浑浊，颜色稍变暗，试管底部出现小颗粒状沉淀，表层有不明显菌膜，不贴壁生长，摇晃后底部沉淀混入菌液，菌液更加浑浊，静置后不久又出现沉淀。

2.2生物学特性鉴定

2.2.1生化特性本菌为革兰氏阳性，微弯曲的无芽孢短杆菌，多单个存在，或排列成“V”、“

Y”字形。生化试验表明：该分离菌能迅速发酵葡萄糖、麦芽糖产酸不产气，可缓慢发酵蔗糖、果糖、乳糖产酸不产气，V-P反应阳性，不还原硝酸盐，甲基红试验呈阳性（表1）。steeel

表1分离菌株的生化特性

Table 1 Biochemical properties of isolated bacteria strains

生化试验 biochemical test	葡萄糖Gluco	果糖Fructo	麦芽糖Malto	蔗糖Sucro	乳糖Lacto	V-P试验V-P test	MR试验MR test	硝酸盐Nitrate
结果Result	+	+	+	+	+	+	+	—

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

Note:”+” indicates positive,”-” indicates negative.

2.2.2抗药性试验

药敏结果按美国临床试验室标准化协会(CLSI，2006)的标准进行判断，其中，卡那霉素判断标准参照红霉素，头孢唑林和头孢噻肟参照青霉素的标准，CLSI未建议使用的药物，仅报告其抑菌圈直径，不做敏感性分析。

选用常用的8种抗菌药检测结果表明，该分离菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素高度敏感，对头孢唑林、左氧氟沙星、和多粘菌素中度敏感；对头孢他啶、头孢呋辛钠耐药性较强（表2，图1）。

表2 分离菌株药敏试验

Table 2 Experiment on medicament nsitivity of isolated bacteria strain

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药物medicament	抑菌圈直径Anti-bacterial circle diameter （mm）
头孢唑林Cefazolin	33.0
多粘菌素Polymyxin	11.2
链霉素Streptomycin	32.3
头孢呋辛钠Cefuroxime	0
头孢他啶Ceftazidime	0
氨苄西林Ampicillin	31.6
左氧氟沙星Levofloxacin	24.3
庆大霉素Gentamicin	26.1