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•论著・
母体循环血清TLR・1、2、4、6水平与胎膜早破
及亚临床绒毛膜羊膜炎关系的研究
朱林凤1，王久阳2，惠玉洁1，王硕1
(北京市平谷区医院1•妇产科，2.病理科，北京101200)
annually［摘要］目的：研究母体循环血清Toll样受体-1(ToU-like receptor1,TLR-1)、TLR-2、TLR-4、TLR-6水平与胎
［收稿日期］2020-10-28［修回日期］2021-01-10
［基金项目］北京市平谷区医院院内科研项目(Pgyy2020-01)
［作者简介］朱林凤(1988-)，女，北京人，主治医师。E-mail：
［通信作者］王久阳E-mail:
［引文格式］朱林凤，王久阳，惠玉洁，等•母体循环血清TLR-1、2、4、6水平与胎膜早破及亚临床绒毛膜羊膜炎关系的研究［J］・东南大学学报(医学版),2021,40(1):33-41.
•34•东南大学学报(医学版)2021年2月，40(1)
膜早破(PROM)及亚临床绒毛膜羊膜炎的关系。方法：收集2019年1月至12月本院520例PROM孕妇(PROM组)，包括249例足月(tPROM组)孕妇和271例未足月(pPROM组)孕妇。另外各选取50例未足月
和足月正常分娩孕妇作为对照组。收集入院时孕妇的血清样本以及新鲜胎膜组织标本。ELISA法检测血清TLR-1、2、4、6水平；qRT-PCR法和免疫组化法检测胎膜组织中TLR-1、2、4、6mRNA及蛋白的表达。根据组
织病理学检测，诊断PROM孕妇是否合并亚临床绒毛膜羊膜炎。结果：与对照组相比,PROM组孕妇血清和
胎膜组织TLR-2、TLR-4表达升高(P<0.05)，且PROM孕妇血清TLR-1、2、4、6水平与胎膜组织中相应的mRNA表达量呈正相关(P<0.001)。根据组织病理学诊断，tPROM组和pPROM组分别有53例(21.29%)
及116例(42.80%)孕妇合并亚临床绒毛膜羊膜炎。与未合并亚临床绒毛膜羊膜炎孕妇相比，合并亚临床绒
毛膜羊膜炎的孕妇血清TLR-2、TLR-4水平均升高(P<0.05)o经多因素Logistic回归分析，血清TLR-2、TLR-4水平升高是发生亚临床绒毛膜羊膜炎的独立危险因素(P<0.05)；且两者用于预测tPROM孕妇和p
PROM孕妇是否合并亚临床绒毛膜羊膜炎,ROC曲线下面积分别为0.657(95%CZ：O.579-0.743),0.668 (95%CZ：O.584-0.759)以及0.793(95%C7：0.711~0.918)、0.813(95%CZ：O.725~0.942)o结论：孕妇血
清TLR-2、TLR-4水平升高与PROM以及合并亚临床绒毛膜羊膜炎有关。检测血清TLR-2、TLR-4水平对于PROM合并亚临床绒毛膜羊膜炎有一定的早期预测价值。
［关键词］胎膜早破；亚临床绒毛膜羊膜炎；Toll样受体；血清；胎膜组织
［中图分类号］R714.25［文献标志码］A［文章编号］1671-6264(2021)01-0033-09
doi：10.3969/j.issn.1671-6264.2021.01.007
Relationship between rum TLR-1,-2,-4,-6levels and premature
rupture of the membranes and subclinical chorioamnioiiitis
ZHU Linfeng1,WANG Jiuyang2,HUI Yujie1,WANG Shuo1
(1.Department of Obstetrics and Gynecology,2.Department of Pathology,Beijing Pinggu Hospital,Beijing101200,China)
［Abstract］Objective:To investigate the relationship between maternal circulating rum toll like receptor1(TLR-1),TLR-2,TLR-4,TLR-6levels and premature rupture of membranes(PROM)or subclinical chorioamnionitis. Methods:520PROM pregnant women(PROM group),including249term(tPROM group)pregnant women and
271preterm(pPROM group)pregnant women,were enrolled from January2019to December2019in our hospital.
In addition,50term and50preterm pregnant women with normal delivery were lected into control group.Serum samples at admission and fresh fetal membranes after delivery were collected.The rum levels of TLR-1,-2,-4,-6 were detected by ELISA；mRNA and protein expressions of TLR-1,-2,-4,-6in fetal membranes were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry.According to the histopathological examination,the diagnosis of subclinical chorioamnionitis was performed in PROM pregnant women.Results:Compared with the control group,the levels of TLR-2and TLR-4in rum or fetal membranes were significantly incread in PROM group(P<0.05).The rum levels of TLR-1,-2,-4,-6were positively correlated with the relative expression of TLRs mRNA in fetal membranes
(P<0.001).According to the histopathological diagnosis,53cas(21.29%)in tPROM group and116cas (42.80%)in pPROM group had subclinical chorioamnionitis.Compared with the pregnant women without subclin
ical chorioamnionitis,the rum levels of TLR-2and TLR-4in tRPOM or pPROM pregnant women with subclinical chorioamnionitis were significantly higher(P<0・05).Multivariate logistic regression analysis showed that the incread rum TLR-2and TLR-4were the independent risk factors of subclinical chorioamnionitis(P<0.05).The area under ROC curve of rum TLR-2and TLR-4for predicting subclinical chorioamnionitis in tPROM or pPROM pregnant women were0.657(95%CZ：0.579-0.743),0.668(95%CZ：0.584-0.759)and0.793(95%CI：
朱林凤，等•母体循环血清TLR・1、2、4、6水平与胎膜早破及亚临床绒毛膜羊膜炎关系的研究・35・
0.711-0.918),0.813(95%CI：0.725-0.942),respectively.Conclusion:The increa of rum TLR-2and TLR-4levels is related with PROM or subclinical chorioamnionitis,which mainly reflects the activation of TLR-2 and TLR-4in fetal membranes of PROM pregnant women.The detection of rum TLR-2and TLR-4levels has an early predictive value for PROM complicated with subclinical chorioamnionitis.
[Key words]premature rupture of membranes；subclinical chorioamnionitis；Toll like receptor；rum；fetal membrane tissue
胎膜早破(premature rupture of the membranes, PROM)在临床上的发生率较高⑴，其确切机制尚不明确，但是慢性感染和炎症是目前已知的引起自发性早产的主要原因⑵。绒毛膜羊膜炎是影响母婴结局最重要的危险因素之一，多数孕产妇由于并没有表现出任何临床症状，属于亚临床绒毛膜羊膜炎，因此在临床上难以确诊⑶。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)属于重要的先天性免疫模式识别受体(innate immune pattern recognition receptor,PRR)，在介导感染所致的炎症反应中发挥着重要作用⑷。目前已经鉴定出10种人类TLR基因编码蛋白，每个基因都能感知不同的感染产物；同样地，不同病原体可能通过特异性TLR 介导的信号机制引起特异性反应⑸。而绒毛膜羊膜也可以通过TLR对病原微生物进行感知和反应，但是对其研究甚少。因此，本研究旨在通过分析母体循环血中TLR-l、TLR-2、TLR-4、TLR-6水平是否与胎膜组织中的基因改变有关，以及与PROM、亚临床绒毛膜羊膜炎的关系。
1对象和方法
1.1研究对象
本研究是一项前瞻性队列研究，于2019年1月至12月在本院妇产科进行。选取520例PROM孕妇(PRO
M组)，包括足月(N37。77孕周)PROM(term premature rupture of the membranes,tPROM)249例［平均年龄(29.76±4.30)岁］和未足月(＜37°〃孕周)PROM (preterm premature rupture of the membranes,pPROM) 271例［平均年龄(30.38±4.75)岁］，即tPROM组和pPROM组。同时选取在本院同时期进行孕检和分娩的50例足月正常孕妇［平均年龄(29.41±7.80)岁］及50例未足月正常孕妇［平均年龄(30.22±4.38)岁］为对照组，正常孕产妇经胎膜病理检査排除绒毛膜羊膜炎。所有孕产妇入院后接受产前护理，在对研究的充分解释后，自愿签署书面同意书(由本院医学伦理委员会提供)。纳入标准:(1)PROM是通过临床检查、羊水外流到阴道、阴道pH值测试、超声检查来确定的，符合《妇产科学》(第8版)⑷的诊断标准;(2)PROM时间＜18h，且在破膜＞18h时注射抗生素预防感染;(3)单胎妊娠;(4)无典型的临床绒毛膜羊膜炎症状(发热、母体或胎儿心动过速、子宫压痛、阴道分泌物有异味)。排除标准：糖尿病、高血压、全身性疾病或严重全身感染史者；多胎妊娠、胎儿畸形、前置胎盘、机械性损伤等者。另外，根据胎盘胎膜组织病理检查提示绒毛膜及羊膜组织炎症细胞＞5个/HP定义为亚临床绒毛膜羊膜炎⑺。
1.2组织标本获取及处理
分娩后15min内在无菌条件下从胎盘中央部分剥离胎膜。用生理盐水和无菌棉纱布从膜上除去蜕膜和黏附的印迹凝块。将这些组织置于含有青霉素/链霉素(10jjl I•ml")和两性霉素B(1jjl I-ml")的Hanks平衡盐溶液中。每个患者取1个胎膜样本，用光镜检査(石蜡包埋切片，分别进行HE染色和免疫组化染色)。
另外取2片致密绒毛组织(约1.0cm X 1.0cmx0.5cm，以避免钙化坏死区)，用DEPC水清洗后放入液氮中10min，然后-80七保存，进行组织总RNA提取。另外采集孕妇入院时、分娩前且使用抗生素前的血液样本5ml，分离血清样本，-80咒保存直至用于检测血清TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-6水平。
1.3血清TLR-l、TLR-2、TLR-4、TLR-6检测
使用酶联免疫吸附检测试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行检测，操作步骤简述如下：将未稀释的血清样本和对照品加入分别涂有抗TLR抗体的孔中，在37咒下培养2h，加入100pl链霉亲和素一辣根过氧化物酶在37七下持续30min，加入显色试剂。在450,620nm波长下，使用酶标仪测定溶液吸光度值。根据对照品拟定一个线性回归校准曲线，计算得出血清TLR-l、TLR-2、TLR-4、TLR-6质量浓度。
1.4胎膜组织总RNA提取和qRT-PCR检测
使用Illustra RNAspin微型分离试剂盒(美国GE Healthcare公司)从胎膜组织中提取总RNA。采用分光光度计测定总RNA的吸光度比值(260nm/ 280nm)，以确定总RNA的质量和浓度。使用cDNA Archive试剂盒(美国Applied Biosystems公司)对RNA (0.1mg•ml-1)进行反转录。用实时荧光定量PCR
・36・
东南大学学报（医学版）2021年2月,40（1）
方法定量分析TLR 的mRNA 表达。PCR 条件：95 °C 变性10 min，然后95 °C 15 s 、60 °C 30 s 进行40次热
循环。所有反应重复进行3次，每次运行中包括阴性 对照。每个样本中TLR 的表达水平用GAPDH 内参基
因进行标准化，以无绒毛膜羊膜炎的足月妊娠的平均
CT 值作为校正值，采用2 "通法对数据进行分析。
1.5免疫组化检测及结果判断
每组随机取5例孕妇组织进行免疫组化染色分析
TLR-l 、TLR-2、TLR-4、TLR-6蛋白表达定位。将组织
切片脱蜡水化，滴加柠檬酸盐缓冲液，煮沸30 min 进 行抗原热修复。PSB 清洗后，用比02在室温下使内源 性过氧化物酶活性猝灭10 min o 分别用多克隆兔抗
TLR-2（ 1 : 400 稀释，美国 Abeam 公司）、TLR-4（1 : 800稀释，美国Abeam 公司）抗体在室温下孵育3 h，用
二抗孵育1 h 。3,30--氨基联苯胺四氢氯化物（DAB ） 对其进行可视化。苏木精复染。阴性对照组省略原抗
体，用PBS 替代。由两名独立的观察者在奥林巴斯
BX41显微镜下对至少10个放大倍数为200的显微镜场
下进行昨，细胞呈明显的棕铮色则视为阳碑色。
1.6统计学处理
采用SPSS 22.0软件包进行统计分析。将计量资
料先进行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布 的以歹土s 表示，采用独立样本t 检验；产次、孕次和血
清TLR-2、TLR-4水平不符合正态分布，以中位值（1/4 分位值,3/4分位值）表示，进行Mann- Whitney U 检
验。计数资料以例（％）表示，采用卡方检验。采用
Pearson 法分析指标之间的相关性。绘制受试者工作
特征（receiver operating characteristic , ROC ）曲线评价 血清TLR-2.TLR-4对亚临床绒毛膜羊膜炎的诊断价 值。采用多因素Logistic 回归模型进行血清TLR-2、
TLR-4与亚临床绒毛膜羊膜炎的相关分析。P<0.05
ziwei
为差异有统计学意义。
2结 果
2.1 4组孕妇和新生儿基础资料比较
两组PROM 与相应的对照组（足月对照组和未足
chau
streak月对照组）相比，年龄、孕龄、孕次、产次、剖宫产率和
新生儿体质量比较，差异无统计学意义（P >0. 05）；另 外tPROM 组和pPROM 组新生儿1 min ,5 min Apgar 评
分分别低于足月对照组和未足月对照组，差异有统计 学意义（P<0.05）o 见表1。
2.2 4 组孕妇血清 TLR-l 、TLR-2、TLR-4、TLR-6 水
平比较
与相应的足月对照组和未足月对照组相比,
tPROM 组和pPROM 组孕妇血清TLR-2、TLR-4水平均
升高，差异均有统计学意义（P < 0. 05）；而血清TLR-
l 、TLR-6水平差异则无统计学意义（P>0.05）o 见
anaemia表2。
表1 4组孕妇和新生儿基础临床资料比较(壬土s)
Tab 1 Comparison of basic clinical data of pregnant women and newborns in 4 groups(x ±s)
组别
n 年龄/岁
孕龄/周
孕次/ 次
产次/ 次
剖宫产/
英语情景剧例
张 译新生儿体 质量/g
1 min Apgar 评分/分
5 min Apgar
评分/分
29.76 +38.76 +
2 994.85 +
7. 84 +9.47 +tPROM 组
249
4.300.951(1,2)
1(0,2)
122(49.0%)
1 239.24 1.79 1.08
29.41 土38.99 土
3 188.07 ±
8.46 土9.88±足月对照组
50
7.80 1.11
1(1,2)1(0,2)18(36.0%)
701.50 1.370.59塚/Z 值
0.477
1.517 1.1750.978
2.824
1.068
2.316
2.605P 值
0.6550.130
0.647
0. 8370.0930.287
0.021
0.010
组别
年龄/岁
孕龄/周
孕次/产次/剖宫产/
新生儿体1 min Apgar 5 min Apgar
n 次
次
例
质量/君
评分/分
人教版七年级英语
评分/分
30.38 +
32.83 +
2142.67 +
7.54 +
9.22 +pPROM 组
271
4.75 2.501(1,3)
atp是什么
1(0,2)
174(64.21)
1541.88 1.80 1.21
30.22 +
33.50 +2347.74 +
& 24 +
9.68 +未足月对照组
50
4.38 2.871(1,2)1(0,2)25(50.0)571.80 1.640.71哎/z 值
0.221
1.700
1.350
0.450
3.616
0.928 2.560
2.605P 值
0.8250.0900.4290.9070.0570.354
0.011
0.010
朱林凤，等.母体循环血清TLR-1、2、4、6水平与胎膜早破及亚临床绒毛膜羊膜炎关系的研究•37•
表24组孕妇血清TLR-1,TLR-2,TLR-4,TLR-6水平比较ng•L1 Tab2The levels of rum TLR-1,TLR-2,TLR-4,TLR-6of pregnant women in4groups ng-L 组别n p(TLR-1)p(TLR-2)p(TLR-4)p(TLR-6) tPROM组24917.98±5.2136.50(23.54,50.18)43.20(25.16,63.80)22.16±6.53足月对照组5019.30±5.8823.94(20.15,29.47)26.30(21.93,32.44)20.74±3.92 t/Z 1.5997.035 5.058 1.573
P值0.111<0.001<0.0010.117组别n p(TLR-1)p(TLR-2)p(TLR-4)p(TLR-6) pPROM组27119.27±6.8044.95(32.60,67.13)63.90(48.16,7&30)23.18±6.61
未足月对照组5018.25±4.3625.37(21.16,30.56)29.10(24.57,35.26)21.56±5.49 "Z值 1.0229.14510.998 1.632
P值0.308<0.001<0.0010.104
2.34组孕妇胎膜组织TLR-1mRNA.TLR-2mR-
NA、TLR-4mRNA、TLR-6mRNA相对表达量与相应的足月对照组和未足月对照组相比,
tPROM组和pPROM组孕妇胎膜组织TLR-2mRNA、TLR-4mRNA相对表达量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而胎膜组织TLR-1mRNA、TLR-6mRNA 相对表达量差异则无统计学意义(P>0.05)o见表3。经Pearson法分析，PROM孕妇血清TLR-l、TLR-2、TLR-4、TLR-6水平与胎膜组织中TLR-1mRNA、TLR-2mRNA、TLR-4mRNA.TLR-6mRNA相对表达量呈正相关,r值分别为0.654、0.817,0.825,0.579，均P< 0.001o
2.44组孕妇胎膜组织TLR-2.TLR-4蛋白表达定位
经免疫组化分析,TLR-2、TLR-4蛋白主要表达于羊膜上皮细胞(amniotic epithelium,ae)、绒毛滋养层细胞(cytotrophoblast layer,ct)和蜕膜细胞(decidua,dec)。结缔组织(connective tissue layer,cl)中TLR-2蛋白和TLR-4蛋白阴性表达或弱表达。见图l o
表34组孕妇胎膜组织中TLR-1mRNA、TLR-2mRNA.TLR-4mRNA.TLR-6mRNA相对表达量
Tab3The relative expressions of TLR-1mRNA,TLR-2mRNA,TLR-4mRNA,TLR-6mRNA in fetal mem-branes of pregnant women in4groups
组别n TLR-1mRNA TLR-2mRNA TLR-4mRNA TLR-6mRNA tPROM组249 1.02±0.19 1.89±0.53 1.95±0.970.97±0.24足月对照组50 1.00±0.08 1.00±0.06 1.00±0.13 1.00±0.09力值0.73111.842 6.9040.871
P值0.466<0.001<0.0010.385
组别n TLR-1mRNA TLR-2mRNA TLR-4mRNA TLR-6mRNA pPROM组271 1.07±0.35 2.66±1.27 3.24±1.68 1.05±0.28未足月对照组500.98±0.14 1.03±0.12 1.05±0.200.99±0.13力值 1.7889.1119.194 1.485
P值0.075<0.001<0.0010.139
2.5PROM合并亚临床绒毛膜羊膜炎孕妇血清别有53例(21.29%)和116例(42.80%)孕妇合并亚TLR-l、TLR-2、TLR-4、TLR-6水平变化临床绒毛膜羊膜炎。与未合并亚临床绒毛膜羊膜炎孕根据组织病理学诊断,tPROM组和pPROM组分妇相比,tPROM组和pPROM 组中合并亚临床绒毛膜
