2021 Vol.40 No.2
•128・ Serial No.348
China Brewing
Rearch Report
一株高产乳酸菌株的鉴定及其发酵特性研究
新gre分数换算
董 玲F ，李 露$，郭云建$，赵 驰F ，罗 静F ，朱鹏程%，杨 永F ，朱永清F ，李治华
(1.四川省农业科学院 农产品加工研究所i 四川 戚都610066; 2.#都区农业农村和林业局i 四川 戚都611730;
3.大竹鹏程果业农民专业合作社i 四川 大竹635100)
摘要：采用MRS 培养基从果醋醋酷中分离具有强产酸能力的乳酸菌，通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴 定，并研究其乙醇耐受能力、产酸能力和抗生素敏。结果表明，果醋醋酷中分得到一株产酸能力较的，编号为D2，并鉴 定其为鼠李糖乳杆菌(Lactobacill:s
，
该菌株在体积分数4%乙醇条件下能够正常生长，在体积分数14%乙醇条件下能够存
活，具有较强的乙醇耐受力；在MRS 肉汤培养基中发酵4Eh 时，总酸含量达到20.03 [L ，其中乳酸含量增加最多，其次是苹果酸和琥珀
酸；对四环素、氯霉素、红霉素和吉他霉素敏，对链霉素、卡那霉素、青霉素、苯k 林和复方新诺明具有耐药。综上，该菌株具有 较 的乙醇耐受 力和产 酸能力，安全 ，有作为发酵菌剂 果醋 味和口 的潜在
。
关键词：乳酸 酸；分 鉴 发酵特
中图分类号:TS255.47 文章编号-0254-5071 (2021)02-0128-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.02.025
引文格式：董玲，李露，郭云建，等•一株高产乳酸菌株的鉴定及其发酵特性研究!J].中国酿造,2021,40(2):128-132.
Identification and fermentation characterization of a high lactic acid-producing bacterium
DONG Ling 1, LI Lu 2, GUO Yunjian 2, ZHAO Chi 1, LUO Jing 1, ZHU Pengcheng 3, YANG Yong 1, ZHU Yongqing 1, LI Zhihua 1*
*收稿日期：2020-08-20
修回日期：2020-11-02
基金项目：四川省农业科学院青年基金(2019QNJJ-023)；四川省农业科学院科技成果中试熟化与示范转化项目(CGZH2018ZC14-7、
CGZH2019XC30)；四川省科技支撑项目(2018NFP0059,2019YFN0073)
作者简介：董 玲(1986-)，女，助理研究员，硕士，研究方向为食品微生物与发酵技术。*通讯作者：李治华(1982-)，男，研究员，博士，研究方向为食品微生物与发酵技术。
([.Institute ofAgro-pro?ucts Processing Science a=? Technology, Sichuan Academy of A gricultural Sciences, Chengdu 610066, China;
2.Agricu9ture, Rural and Forestry Bureau ofPidu District, Chengdu 611730, China; S.Dazhu Pengcheng Farmers' Fruit-Specific
Cooperative Organization, Dazhu 635100, China)
Abstract ： A bacterium with high lactic acid-producing ability was isolated by MRS medium from fruit vinegar Cupei, and identified by morphological ob
rvation, physiological and biochemical tests and molecular biology technology. Its ethanol tolerance, acid production and antibiotic susceptibility were
studied. The results showed that the strain with high acid-producing capacity was isolated from fruit vinegar Cupei, numbered as D2, and it was identified
as Lactobacillus rhamnosus . The strain had strong ethanol tolerance, which could grow normally in MSR broth with 4% ethanol and survive at 14% ethanol. The total acid content was 20.03 g/L after fermentation 48 h in MRS broth, and the lactic acid content incread the most, followed by malic acid and suc
cinic acid. The strain D2 was nsitive to tetracycline, chloramphenicol, erythromycin and kitasamycin, but was resistant to streptomycin, kanamycins, peni
cillin, oxacillin and compound sulfamethoxazole . In conclusion, the strain D2 had strong ethano
l tolerance and high lactic acid-producing ability, with high
safety, which had potential application value as fermentation starter to improve the flavor and taste of fruit vinegar.
Key words ： lactic acid bacteria; lactic acid; isolation; identification; fermentation characteristic
水果具有生产上市时间较为集中，货架期短、不耐贮 存的特点，极易出现旺季滞销的问题叫果醋属于水果精深
加工产品眄选择适宜品种进行果醋加工是解决水果滞销 的一个有效途径。果醋既具有传统醋的酸味物质，又具有
水果的果香味和营养成分，被誉为第四代饮料冋。传统的 果醋发酵主要分为两个阶段，第一个阶段是 酵母(.Saccharomyces cerevisiae )将水果汁中的糖分发酵成酒精, 第二个段是 醋酸
成醋酸。
这种
发酵方式生产的果醋存在酸味单一、口刺激的问题。： 加酸发酵是 果醋味的一个途径，果醋中 发
酸的主要成分是 酸, 酸 成分一 果醋和 的味叫醋中有 的酸 种 ，
产酸 酸 在 醋 中具有一 的
F
[5]
醋发 中分 选 1 产酸、
高产乙偶姻的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和1株
发酵挥发成分
的 Pediococcus pen-
tosaceus ,
于
醋发酵,
醋酸、 发酸和 的 问从
香醋醋 中分
一
Lactobacillus
helveticus ,
于 醋 发酵, 有效 醋酸
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研究报告
发酵周期、提高乳酸相对含量、改善食醋口感。然而目前 关于从果醋醋酷分离高产酸乳酸菌的研究鲜见报道。
本研究采用MRS 培养基从桃果醋醋酷中分离具有强 产酸能力的乳酸菌，通过形态观察、生理生化试验及分子 生物学技术对其进行鉴定，并研究其乙醇耐受能力、产酸
能力和抗生素敏感性，从而筛选出具有改善果醋风味品质 的乳酸菌菌
1材料与方法1.1材料与试剂
桃果醋醋酷：大竹鹏程果业农民专业合作社;MRS 肉 汤培养基、MRS
培养基
生物术有
乙醇 分 、 酸 分 、 生化试化试
DL )果酸、D -
酸、酸、富
马酸、草酸、柠檬酸、乙酸、厶乳酸、奎宁酸标准品：美国Sigma ；抗生素 生物试剂有 ； 基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid , DNA)快速抽提试 剂盒、2x Tag 聚合酶链式反应(polymera chain reaction ,
PCR)Master Mix 、引物27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCT-
CAG-3')、引物 1492R(5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'): 生工生物
有 -BHI 乳酸菌生化鉴定
高
生物 术有
1.2仪器与设备
HPX-87H 相分析柱：美国伯乐公司-AC2-6S1二级生
物 Esco ；CP153 分
有 ；YXQ-LS-50SII
力蒸汽灭菌：海博迅实业有限公司:1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography , HPLC)仪：美国安捷伦：公司； FlexCycle PCR 德 耶拿分
有限公司；SUP-250生
化培养箱 精宏实验设备有 ；HBM-400拍击式均 津恒 发展有 ；5810R 台式冷冻离心
机：德国Eppendorf 公司；Synergy HTX 多功能微孔板检测仪： 伯腾 有限公
1.3方法
1.3.1乳酸菌菌株的分离纯化
称取10 g 桃果醋醋酷到100 -L 无菌生理盐水中，用拍
击式均 拍打混匀，取1 mL 均 到9 mL 无菌生理盐 水进行梯度稀释，取10气10-7、10"8倍稀释液100 “L 到含1% CaCO 3的MRS 固体平板，涂布,37 "培养48 h ，挑取具有最
大溶钙圈的菌落接种到含1%CaCO 3的MRS 固体平板反复 划线化获得菌1.3.2分离菌株的鉴定
形态观察：将分离菌株接种到MRS 固体平板上,37 " 培养48 h ，观察菌落形态和显微形态。
生理生化试验：将分离菌划线接种到MRS
板上,37"培养24 h 长出单菌落，随机挑取2个平板上的单菌 落分别用生理盐水制菌悬液，根据说明书接种到BHI 乳
酸菌生化鉴定条,37"培养24 h ，记录实验结果。
分子生物学鉴定：将分离菌株D2接种到MRS 肉培养
基,37 "培养24 h ，取1 mL 菌液12 000x g 离心5 min 后，弃上 清，取菌 沉淀用作DNA 提取，具体操作按
基
DNA 提试 说明书进行 提取的基 DNA
为模板对分离菌的16SrDNA 基
进行PCR 扩增。
PCR 扩增体系:DNA 1 !L , PCR 引物27F (10 p mol/L)和 1492R (10 “mol/L)各 1 !L ,2x Taq PCR M
aster Mix 25 “L 、双蒸水
(ddHO) 22 “L ； PCR 等口的方法进行。PCR 产物送到 生工生物 有 进行
纯化和测
测结果提交至
生物术息中
心 national center for biotechnology information , NCBI 的
GenBank 数据中进行 冏，选取与分离菌
性较高的10
菌的16S rDNA 基
，用MEGA
6.06 中的接(neighbor-joining , NJdepend
[9]«
1.3.3分离菌株对乙醇的耐受性
将分离菌 接种到30 mL MRS 肉汤培养基中，37 "静 置培养24 h 。分别取以上培养液600 “L 接种到30 mL 含0、2%、
4%、6%、8%、10%、12%、14% (V /e 乙醇的MRS 肉汤培养基 中，接种3个平行,37 "静置培养24 h ，取200 “L 培养 到96 孔板，用Synergy HTX 能孔板检测仪测定OD®皿。
1.3.4分离菌株的产酸能力
取300 “L 分离菌株培养液接种到30 mL MRS 液体培 养基，接种3个平行,37 "
培养24 h 、48 h 、72 h ，将培养
12 000x g 离心10 min ，取上清 测定总酸和有机酸 。
总酸含量 乳酸计)测定 [10]用定法测
定。有机酸含量测定 MRS 肉汤培养基 ,
[11]用高效液相色谱法测定。
1.3.5分离菌株对抗生素的敏感性
将100 “L 分离菌培养涂布到MRS 固体平板，将抗
生素 MRS 板 ,37 "培养24 h , 种抗生素
3个平行，观察菌圈情况》叫
2结果与分析
2.1乳酸菌菌株的分离纯化
通过MRS 培养基从桃果醋醋酷中分离纯化得到溶钙圈最 的菌 , D2, 于中 生物菌
种保藏管理 通微生物中心，保藏编号为CGMCC
No 1.16283 2.2菌株D2的鉴定
2.2.1形态观察结果
菌D2 MRS 固体培养基上培养48 h 的菌落及细胞 形态见1
1 ，菌D2的菌落突起、
、
、乳色、 明，菌落 1〜2 mm , 等网
鉴定的鼠李糖乳杆(Lactobacillus rhamnosu^菌菌落形态一
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致。用革兰氏染色液染色后，在油镜下观察细胞形态，其为
短杆状、单个或线性排列，这与COLLINS M D 等问报道的 鼠李糖乳杆菌标准菌株的细胞形态一致。
winterinmyheart
2.3菌株D2对乙醇的耐受性试验结果
菌株D2在
醇的MRS 肉汤培养基中
的生
3。
a b
rhea
图1菌株D2的菌落(a )及细胞(b )形态
Fig. 1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strain D2
图3菌株D2的乙醇耐受性试验结果
Fig. 3 Results of ethanol toleranee tests of strain D2
2.2.2生理生化试验结果
挑取1个单菌落到2 mL 无菌生理盐水制成菌悬液，采
用海博生物H6I 乳酸菌生化鉴定条进行生理生化鉴定，发 酵七叶q 、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨q 、山梨醇、蔗
糖、菊糖 乳糖均为 性，发酵 糖为 性，与鼠李糖 乳杆菌标准菌株(JCM1136) “切糖发酵能力一致。223分子生物学鉴定结果
菌株D2的16SrDNA 基因序列碱基长度为1 491 bp +其 序列与鼠李糖乳杆菌(Lactobac 诅us rhamnosu
s ) JCM 1136 相似性最高，相似性为98.21%，其次与干酪乳杆菌(Lacto-
bacillus cai ) ATCC 393相似性为97.31%。选取与菌株D2
16S rDNA 基因序列相似性最高的10株模式菌株的16S rDNA 基因序列 发， 2。 2 ，菌株D2与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus ) JCM 1136聚于 一—
最，因此，结合形态观察、生理生化
mxt果，鉴定菌株D2为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus )。
鼠李糖乳杆菌 列为 用 的菌 单 ， 的无 、无 用的 生菌， 用 发酵。
3
，菌株D2在 的 生-且在 0〜4%醇的MRS
生长能
一致,6%〜14% 醇的高，
0〜4%乙醇 菌株D2生 制。当乙醇
为6%〜14%，
醇
的增
，菌株D2的OD^nm , 醇 高，对菌株D2的生 制性越强。金丹等购
12株乳酸菌的 醇
，
3株菌在 14%下
- !2%，7
一株 为2%的菌株为鼠李糖乳杆菌威良等凹
10株
乳酸菌菌的
耐受能力,7中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李
国防大学分数线糖乳杆菌、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracai )相比7他
7株乳酸菌具更的
本 菌株D2在
量14%下还具有一定的生
，菌株D2也为鼠
李糖乳杆菌，推测鼠李糖乳杆菌类 带
。
2.4菌株D2产酸能力分析结果pdl
菌株D2发酵液 的总酸 量见图4。
61
Lactobacillusparacai subsp. tolerans JCM 1171 (D16550)L Lactobacillus cai ATCC 393 (FM177140)Lactobacillusparacai subsp. paracai ATCC 25302 (ACGY01000162)
」
Lactobacillus zeae ATCC 15820 (D86516)
-9?- Lactobacillus chiayiensis NCYUAS (NCYUASMF446960)
厂
O'
vhnmnnvuv TO1VT 1 1 AT T01781
ioo[l 100
9937§2 [Lactobacillus rhamnosus JCM 1136 (BALT01000058)
-------------------Lactobacillus yichunensis 33-1 (MK110845)
----------Lactobacillus brantae DSM 23927 (AYZQ01000010) -----------Lactobacillus saniviri DSM 24301 (JQCE01000025)
■Lactobacillusjixianensis 159-4 (MK110836)-------------------Bacillus subtilis NCDO 1769 (X60646)
图4菌株D2发酵液中的总酸含量
Fig. 4 Total acid content in fermentation broth of strain D2
图2基于16S rDNA 基因序列菌株D2的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree of strain D2 bad on 16S rDNA gene
hinting
quences
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中国酿造
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由图4可知，菌株D2发酵24 h 时，发酵液中总酸含量为 16.4 g/L +发酵48 h 时总酸含量为20.03 g/L +发酵72 h 时总酸 含量为19.97 g/L ，表明发酵48 h 时+发酵液中总酸含量基本 趋于稳定。采用高效液相色谱仪检测发酵48 h 的发酵液
中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、奎宁酸、琥珀酸、乳酸、 乙酸、富马酸等有机酸含量，具体结果见表1。由表1可知, 发酵液中乳酸含量最高，为（17.45±0.06） g/L ，其次是乙酸 （4.06±0.04） g/L 和柠檬酸（1.35±0.07） g/L ，乳酸含量增加
最多，其次是苹果酸和琥珀酸。柠檬酸含量低于MRS 肉汤 培养基，酒石酸、奎宁酸和富马酸未检出。可能是由于乳酸
菌在厌氧条件下将
酸 乙酸和H +,H 7将 酸
琥珀酸，
发酵液中乙酸和琥珀酸含量增加[叫草
酸、琥珀酸和苹果酸是
酸 径的中间 物，其
在发酵过程中不会 累 多刖。菌株D2发酵液中总酸含量
为20.03 g/L ，陈卓等8229从四川鉄醋醋酷中分离到的鼠李糖 乳杆菌总酸含量仅为1.97 g/L 。
g/L
表1菌株D2 48 h 发酵液中有机酸检测结果
Table 1 Determination results of orgainic acids in fermentatioin broth of strain D2 at 48 h
样品草酸柠檬酸酒石酸苹果酸奎宁酸琥珀酸乳酸乙酸富马酸菌株D2发酵液
0.28±0.00
1.35±0.07— 1.12±0.18—0.65±0.06英文单词
17.45±0.06 4.06±0.04—MRS 肉汤培养基
0.05±0.01
1.46±0.12
—
0.05±0.06delayed
—
—
0.21±0.03
3.91±0.09
—
注:“一”表不未检出。
2.5菌株D2对抗生素的敏感性试验结果
菌株D2 的 结果见表2和图5。由表2
及图5可知，菌株D2
、 （ ）、
（纟
、
）， 基 （ 、
）、
（
、 ）和 （
明）具有
。菌株D2
基
结果与
NAWAZ M 等8239的
结果 ，乳酸菌 和卡
那霉素具有抗性。菌株D2对四环素具有抗性，而SHARMA P
等8249 9株 乳菌的
，其中有一
株
具有 , 明菌株 的
在个体
。
表2菌株D2抗生素敏感试验结果
Table 2 Results of antibiotic susceptibility tests of strain D2
编号名称含量/片抑菌圈直径/mm
敏感性1氨]西林10 !g
17.1±2.83I 2
卡那霉素
30 !g
10.3±0.54R
3四环素30 !g
22.5±0.71S 4氯霉素30 !g
25.3±0.35S 5
红霉素
15 !g 25.8±0.11
S 6复方新诺明23.75 〜25 !g
-R
7
吉他霉素
15 !g
25.5±0.71
S 8苯哩西林1 !g
11.2±2.83R
9
克林霉素2 !g
16.8±2.12I 10
链霉素
10 !g 10.8±0.35R 11青霉素
10 U 23.5±2.12
R
12新霉素30 !g
16.1±1.27I
注:“ R ”表示具有耐药性；“ I ”表示具有中介;“ S ”表示具有敏感性。
1〜12为表2中抗生素相应的编号。图5菌株D2抗生素敏感效果
Fig. 5 Effect of antibiotic susceptibility of strain D2
3结论
过MRS 体培养基 果 中 1株具有 酸能的乳酸菌，
为D2, 、
物
定为鼠李糖乳 菌（Lactobacillus
rhamnosus ） 0 菌株在体 4%乙 下能够正常生长，在体
14%乙下能
，具有较乙耐受力；在
MRS 肉汤培养基中发酵48 h 时，总酸含量达到20.03 g/L ，其
中乳酸含量增加最多，其次是苹果酸和琥珀酸；
、
（ ）、 （纟 、 ）,
基 （ 、
）、 （ 、）和 （
明）具有耐药 。 菌株具有
较的乙耐受能和产乳酸能，安全高，有一定的
开发利用价值。
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