一株高产乳酸菌株的鉴定及其发酵特性研究

更新时间:2023-07-09 20:06:01 阅读: 评论:0

2021 Vol.40 No.2
•128・ Serial  No.348
China  Brewing
Rearch  Report
一株高产乳酸菌株的鉴定及其发酵特性研究
新gre分数换算
董 玲F ,李 露$,郭云建$,赵 驰F ,罗 静F ,朱鹏程%,杨 永F ,朱永清F ,李治华
(1.四川省农业科学院 农产品加工研究所i 四川 戚都610066; 2.#都区农业农村和林业局i 四川 戚都611730;
3.大竹鹏程果业农民专业合作社i 四川 大竹635100)
摘要:采用MRS 培养基从果醋醋酷中分离具有强产酸能力的乳酸菌,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴 定,并研究其乙醇耐受能力、产酸能力和抗生素敏。结果表明,果醋醋酷中分得到一株产酸能力较的,编号为D2,并鉴 定其为鼠李糖乳杆菌(Lactobacill:s
该菌株在体积分数4%乙醇条件下能够正常生长,在体积分数14%乙醇条件下能够存
活,具有较强的乙醇耐受力;在MRS 肉汤培养基中发酵4Eh 时,总酸含量达到20.03 [L ,其中乳酸含量增加最多,其次是苹果酸和琥珀
酸;对四环素、氯霉素、红霉素和吉他霉素敏,对链霉素、卡那霉素、青霉素、苯k 林和复方新诺明具有耐药。综上,该菌株具有 较 的乙醇耐受 力和产 酸能力,安全 ,有作为发酵菌剂 果醋 味和口 的潜在
关键词:乳酸 酸;分 鉴 发酵特
中图分类号:TS255.47 文章编号-0254-5071 (2021)02-0128-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.02.025
引文格式:董玲,李露,郭云建,等•一株高产乳酸菌株的鉴定及其发酵特性研究!J].中国酿造,2021,40(2):128-132.
Identification  and  fermentation  characterization  of  a  high  lactic  acid-producing  bacterium
DONG  Ling 1, LI  Lu 2, GUO  Yunjian 2, ZHAO  Chi 1, LUO  Jing 1, ZHU  Pengcheng 3, YANG  Yong 1, ZHU  Yongqing 1, LI  Zhihua 1*
*收稿日期:2020-08-20
修回日期:2020-11-02
基金项目:四川省农业科学院青年基金(2019QNJJ-023);四川省农业科学院科技成果中试熟化与示范转化项目(CGZH2018ZC14-7、
CGZH2019XC30);四川省科技支撑项目(2018NFP0059,2019YFN0073)
作者简介:董 玲(1986-),女,助理研究员,硕士,研究方向为食品微生物与发酵技术。*通讯作者:李治华(1982-),男,研究员,博士,研究方向为食品微生物与发酵技术。
([.Institute  ofAgro-pro?ucts  Processing  Science  a=? Technology, Sichuan  Academy  of  A gricultural  Sciences, Chengdu  610066, China;
2.Agricu9ture, Rural  and  Forestry  Bureau  ofPidu  District, Chengdu  611730, China; S.Dazhu  Pengcheng  Farmers' Fruit-Specific
Cooperative  Organization, Dazhu  635100, China)
Abstract : A  bacterium  with  high  lactic  acid-producing  ability  was  isolated  by  MRS  medium  from  fruit  vinegar  Cupei, and  identified  by  morphological  ob ­
rvation, physiological  and  biochemical  tests  and  molecular  biology  technology. Its  ethanol  tolerance, acid  production  and  antibiotic  susceptibility  were
studied. The  results  showed  that  the  strain  with  high  acid-producing  capacity  was  isolated  from  fruit  vinegar  Cupei, numbered  as  D2, and  it  was  identified
as  Lactobacillus  rhamnosus . The  strain  had  strong  ethanol  tolerance, which  could  grow  normally  in  MSR  broth  with  4% ethanol  and  survive  at  14% ethanol. The  total  acid  content  was  20.03 g/L  after  fermentation  48 h  in  MRS  broth, and  the  lactic  acid  content  incread  the  most, followed  by  malic  acid  and  suc ­
cinic  acid. The  strain  D2 was  nsitive  to  tetracycline, chloramphenicol, erythromycin  and  kitasamycin, but  was  resistant  to  streptomycin, kanamycins, peni ­
cillin, oxacillin  and  compound  sulfamethoxazole . In  conclusion, the  strain  D2 had  strong  ethano
l  tolerance  and  high  lactic  acid-producing  ability, with  high
safety, which  had  potential  application  value  as  fermentation  starter  to  improve  the  flavor  and  taste  of  fruit  vinegar.
Key  words : lactic  acid  bacteria; lactic  acid; isolation; identification; fermentation  characteristic
水果具有生产上市时间较为集中,货架期短、不耐贮 存的特点,极易出现旺季滞销的问题叫果醋属于水果精深
加工产品眄选择适宜品种进行果醋加工是解决水果滞销 的一个有效途径。果醋既具有传统醋的酸味物质,又具有
水果的果香味和营养成分,被誉为第四代饮料冋。传统的 果醋发酵主要分为两个阶段,第一个阶段是 酵母(.Saccharomyces  cerevisiae )将水果汁中的糖分发酵成酒精, 第二个段是 醋酸
成醋酸。
这种
发酵方式生产的果醋存在酸味单一、口刺激的问题。: 加酸发酵是 果醋味的一个途径,果醋中 发
酸的主要成分是 酸, 酸 成分一 果醋和 的味叫醋中有 的酸 种 ,
产酸 酸 在 醋 中具有一 的
F
[5]
醋发 中分 选 1 产酸、
高产乙偶姻的植物乳杆菌(Lactobacillus  plantarum)和1株
发酵挥发成分
的 Pediococcus  pen-
tosaceus  ,
醋发酵,
醋酸、 发酸和 的 问从
香醋醋 中分
Lactobacillus
helveticus  ,
于 醋 发酵, 有效 醋酸
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中国酿造
研究报告
发酵周期、提高乳酸相对含量、改善食醋口感。然而目前 关于从果醋醋酷分离高产酸乳酸菌的研究鲜见报道。
本研究采用MRS 培养基从桃果醋醋酷中分离具有强 产酸能力的乳酸菌,通过形态观察、生理生化试验及分子 生物学技术对其进行鉴定,并研究其乙醇耐受能力、产酸
能力和抗生素敏感性,从而筛选出具有改善果醋风味品质 的乳酸菌菌
1材料与方法1.1材料与试剂
桃果醋醋酷:大竹鹏程果业农民专业合作社;MRS 肉 汤培养基、MRS
培养基
生物术有
乙醇 分 、 酸 分 、 生化试化试
DL )果酸、D -
酸、酸、富
马酸、草酸、柠檬酸、乙酸、厶乳酸、奎宁酸标准品:美国Sigma  ;抗生素 生物试剂有 ; 基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic  acid , DNA)快速抽提试 剂盒、2x Tag 聚合酶链式反应(polymera  chain  reaction ,
PCR)Master  Mix 、引物27F  (5'-AGAGTTTGATCMTGGCT-
CAG-3')、引物 1492R(5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'): 生工生物
有 -BHI 乳酸菌生化鉴定
生物 术有
1.2仪器与设备
HPX-87H 相分析柱:美国伯乐公司-AC2-6S1二级生
物 Esco  ;CP153 分
有 ;YXQ-LS-50SII
力蒸汽灭菌:海博迅实业有限公司:1260高效液相色谱(high  performance  liquid  chromatography , HPLC)仪:美国安捷伦:公司; FlexCycle  PCR  德 耶拿分
有限公司;SUP-250生
化培养箱 精宏实验设备有 ;HBM-400拍击式均 津恒 发展有 ;5810R 台式冷冻离心
机:德国Eppendorf 公司;Synergy  HTX 多功能微孔板检测仪: 伯腾 有限公
1.3方法
1.3.1乳酸菌菌株的分离纯化
称取10 g 桃果醋醋酷到100 -L 无菌生理盐水中,用拍
击式均 拍打混匀,取1 mL 均 到9 mL 无菌生理盐 水进行梯度稀释,取10气10-7、10"8倍稀释液100 “L 到含1% CaCO 3的MRS 固体平板,涂布,37 "培养48 h ,挑取具有最
大溶钙圈的菌落接种到含1%CaCO 3的MRS 固体平板反复 划线化获得菌1.3.2分离菌株的鉴定
形态观察:将分离菌株接种到MRS 固体平板上,37 " 培养48 h ,观察菌落形态和显微形态。
生理生化试验:将分离菌划线接种到MRS
板上,37"培养24 h 长出单菌落,随机挑取2个平板上的单菌 落分别用生理盐水制菌悬液,根据说明书接种到BHI 乳
酸菌生化鉴定条,37"培养24 h ,记录实验结果。
分子生物学鉴定:将分离菌株D2接种到MRS 肉培养
基,37 "培养24 h ,取1 mL 菌液12 000x g 离心5 min 后,弃上 清,取菌 沉淀用作DNA 提取,具体操作按
DNA  提试 说明书进行 提取的基 DNA
为模板对分离菌的16SrDNA 基
进行PCR 扩增。
PCR 扩增体系:DNA  1 !L , PCR 引物27F  (10 p mol/L)和 1492R  (10 “mol/L)各 1 !L ,2x  Taq  PCR  M
aster  Mix  25 “L 、双蒸水
(ddHO) 22 “L ; PCR  等口的方法进行。PCR  产物送到 生工生物 有 进行
纯化和测
测结果提交至
生物术息中
心 national  center  for  biotechnology  information  , NCBI  的
GenBank 数据中进行 冏,选取与分离菌
性较高的10
菌的16S  rDNA 基
,用MEGA
6.06 中的接(neighbor-joining , NJdepend
[9]«
1.3.3分离菌株对乙醇的耐受性
将分离菌 接种到30 mL  MRS 肉汤培养基中,37 "静 置培养24 h 。分别取以上培养液600 “L 接种到30 mL 含0、2%、
4%、6%、8%、10%、12%、14% (V /e  乙醇的MRS 肉汤培养基 中,接种3个平行,37 "静置培养24 h ,取200 “L 培养 到96 孔板,用Synergy  HTX  能孔板检测仪测定OD®皿。
1.3.4分离菌株的产酸能力
取300 “L 分离菌株培养液接种到30 mL  MRS 液体培 养基,接种3个平行,37 "
培养24 h 、48 h 、72 h ,将培养
12 000x g 离心10 min ,取上清 测定总酸和有机酸 。
总酸含量 乳酸计)测定 [10]用定法测
定。有机酸含量测定 MRS 肉汤培养基 ,
[11]用高效液相色谱法测定。
1.3.5分离菌株对抗生素的敏感性
将100 “L 分离菌培养涂布到MRS 固体平板,将抗
生素 MRS  板 ,37 "培养24 h , 种抗生素
3个平行,观察菌圈情况》叫
2结果与分析
2.1乳酸菌菌株的分离纯化
通过MRS  培养基从桃果醋醋酷中分离纯化得到溶钙圈最 的菌 , D2, 于中 生物菌
种保藏管理 通微生物中心,保藏编号为CGMCC
No  1.16283 2.2菌株D2的鉴定
2.2.1形态观察结果
菌D2 MRS 固体培养基上培养48 h 的菌落及细胞 形态见1
1 ,菌D2的菌落突起、
、乳色、 明,菌落 1〜2 mm , 等网
鉴定的鼠李糖乳杆(Lactobacillus  rhamnosu^菌菌落形态一
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致。用革兰氏染色液染色后,在油镜下观察细胞形态,其为
短杆状、单个或线性排列,这与COLLINS  M  D 等问报道的 鼠李糖乳杆菌标准菌株的细胞形态一致。
winterinmyheart
2.3菌株D2对乙醇的耐受性试验结果
菌株D2在
醇的MRS 肉汤培养基中
的生
3。
a  b
rhea
图1菌株D2的菌落(a )及细胞(b )形态
Fig. 1 Colonial  (a) and  cell  (b) morphology  of  strain  D2
图3菌株D2的乙醇耐受性试验结果
Fig. 3 Results  of  ethanol  toleranee  tests  of  strain  D2
2.2.2生理生化试验结果
挑取1个单菌落到2 mL 无菌生理盐水制成菌悬液,采
用海博生物H6I 乳酸菌生化鉴定条进行生理生化鉴定,发 酵七叶q 、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨q 、山梨醇、蔗
糖、菊糖 乳糖均为 性,发酵 糖为 性,与鼠李糖 乳杆菌标准菌株(JCM1136) “切糖发酵能力一致。223分子生物学鉴定结果
菌株D2的16SrDNA 基因序列碱基长度为1 491 bp +其 序列与鼠李糖乳杆菌(Lactobac 诅us  rhamnosu
s ) JCM  1136 相似性最高,相似性为98.21%,其次与干酪乳杆菌(Lacto-
bacillus  cai ) ATCC  393相似性为97.31%。选取与菌株D2
16S  rDNA 基因序列相似性最高的10株模式菌株的16S  rDNA  基因序列 发, 2。 2 ,菌株D2与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus  rhamnosus ) JCM  1136聚于 一—
最,因此,结合形态观察、生理生化
mxt果,鉴定菌株D2为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus  rhamnosus )。
鼠李糖乳杆菌 列为 用 的菌 单 , 的无 、无 用的 生菌, 用 发酵。
3
,菌株D2在 的 生-且在 0〜4%醇的MRS
生长能
一致,6%〜14% 醇的高,
0〜4%乙醇 菌株D2生 制。当乙醇
为6%〜14%,
的增
,菌株D2的OD^nm  , 醇 高,对菌株D2的生 制性越强。金丹等购
12株乳酸菌的 醇
3株菌在 14%下
- !2%,7
一株 为2%的菌株为鼠李糖乳杆菌威良等凹
10株
乳酸菌菌的
耐受能力,7中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus  acidophilus)、鼠李
国防大学分数线糖乳杆菌、副干酪乳杆菌(Lactobacillus  paracai )相比7他
7株乳酸菌具更的
本 菌株D2在
量14%下还具有一定的生
,菌株D2也为鼠
李糖乳杆菌,推测鼠李糖乳杆菌类 带
2.4菌株D2产酸能力分析结果pdl
菌株D2发酵液 的总酸 量见图4。
61
Lactobacillusparacai  subsp. tolerans  JCM  1171 (D16550)L  Lactobacillus  cai  ATCC  393 (FM177140)Lactobacillusparacai  subsp. paracai  ATCC  25302 (ACGY01000162)
Lactobacillus  zeae  ATCC  15820 (D86516)
-9?- Lactobacillus  chiayiensis  NCYUAS  (NCYUASMF446960)
O'
vhnmnnvuv  TO1VT  1 1 AT  T01781
ioo[l 100
9937§2 [Lactobacillus  rhamnosus  JCM  1136 (BALT01000058)
-------------------Lactobacillus  yichunensis  33-1 (MK110845)
----------Lactobacillus  brantae  DSM  23927 (AYZQ01000010) -----------Lactobacillus  saniviri  DSM  24301 (JQCE01000025)
■Lactobacillusjixianensis  159-4 (MK110836)-------------------Bacillus  subtilis  NCDO  1769 (X60646)
图4菌株D2发酵液中的总酸含量
Fig. 4 Total  acid  content  in  fermentation  broth  of  strain  D2
图2基于16S  rDNA 基因序列菌株D2的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic  tree  of  strain  D2 bad  on  16S  rDNA  gene
hinting
quences
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由图4可知,菌株D2发酵24 h 时,发酵液中总酸含量为 16.4 g/L +发酵48 h 时总酸含量为20.03 g/L +发酵72 h 时总酸 含量为19.97 g/L ,表明发酵48 h 时+发酵液中总酸含量基本 趋于稳定。采用高效液相色谱仪检测发酵48 h 的发酵液
中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、奎宁酸、琥珀酸、乳酸、 乙酸、富马酸等有机酸含量,具体结果见表1。由表1可知, 发酵液中乳酸含量最高,为(17.45±0.06) g/L ,其次是乙酸 (4.06±0.04) g/L 和柠檬酸(1.35±0.07) g/L ,乳酸含量增加
最多,其次是苹果酸和琥珀酸。柠檬酸含量低于MRS 肉汤 培养基,酒石酸、奎宁酸和富马酸未检出。可能是由于乳酸
菌在厌氧条件下将
酸 乙酸和H +,H 7将 酸
琥珀酸,
发酵液中乙酸和琥珀酸含量增加[叫草
酸、琥珀酸和苹果酸是
酸 径的中间 物,其
在发酵过程中不会 累 多刖。菌株D2发酵液中总酸含量
为20.03 g/L ,陈卓等8229从四川鉄醋醋酷中分离到的鼠李糖 乳杆菌总酸含量仅为1.97 g/L 。
g/L
表1菌株D2 48 h 发酵液中有机酸检测结果
Table  1 Determination  results  of  orgainic  acids  in  fermentatioin  broth  of  strain  D2 at  48 h
样品草酸柠檬酸酒石酸苹果酸奎宁酸琥珀酸乳酸乙酸富马酸菌株D2发酵液
0.28±0.00
1.35±0.07—  1.12±0.18—0.65±0.06英文单词
17.45±0.06  4.06±0.04—MRS 肉汤培养基
0.05±0.01
1.46±0.12
0.05±0.06delayed
0.21±0.03
3.91±0.09
注:“一”表不未检出。
2.5菌株D2对抗生素的敏感性试验结果
菌株D2 的 结果见表2和图5。由表2
及图5可知,菌株D2
、 ( )、
(纟
), 基 ( 、
)、
、 )和 (
明)具有
。菌株D2
结果与
NAWAZ  M 等8239的
结果 ,乳酸菌 和卡
那霉素具有抗性。菌株D2对四环素具有抗性,而SHARMA  P
等8249 9株 乳菌的
,其中有一
具有 , 明菌株 的
在个体
表2菌株D2抗生素敏感试验结果
Table  2 Results  of  antibiotic  susceptibility  tests  of  strain  D2
编号名称含量/片抑菌圈直径/mm
敏感性1氨]西林10 !g
17.1±2.83I 2
卡那霉素
30 !g
10.3±0.54R
3四环素30 !g
22.5±0.71S 4氯霉素30 !g
25.3±0.35S 5
红霉素
15 !g 25.8±0.11
S 6复方新诺明23.75 〜25 !g
-R
7
吉他霉素
15 !g
25.5±0.71
S 8苯哩西林1 !g
11.2±2.83R
9
克林霉素2 !g
16.8±2.12I 10
链霉素
10 !g 10.8±0.35R 11青霉素
10 U 23.5±2.12
R
12新霉素30 !g
16.1±1.27I
注:“ R ”表示具有耐药性;“ I  ”表示具有中介;“ S  ”表示具有敏感性。
1〜12为表2中抗生素相应的编号。图5菌株D2抗生素敏感效果
Fig. 5 Effect  of  antibiotic  susceptibility  of  strain  D2
3结论
过MRS 体培养基 果 中 1株具有 酸能的乳酸菌,
为D2, 、
定为鼠李糖乳 菌(Lactobacillus
rhamnosus ) 0 菌株在体 4%乙 下能够正常生长,在体
14%乙下能
,具有较乙耐受力;在
MRS 肉汤培养基中发酵48 h 时,总酸含量达到20.03 g/L ,其
中乳酸含量增加最多,其次是苹果酸和琥珀酸;
( )、 (纟 、 ),
基 ( 、
)、 ( 、)和 (
明)具有耐药 。 菌株具有
较的乙耐受能和产乳酸能,安全高,有一定的
开发利用价值。
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