玉米须中抑制黄嘌呤氧化酶活性组分的筛选及其作用
数字用英语怎么念姜彤伟;徐建;王晓明;陈雪松;邱智东
yarn【摘 要】目的:提取玉米须中具有抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)作用的活性组分,为进一步开发治疗痛风的中药新药提供依据.方法:通过测定黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生尿酸和超氧离子的生成量,得出玉米须不同溶剂提取物(乙醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物)及不同溶剂(水和10%、30%、50%、70%、90%乙醇)纯化得到的活性组分对XOD活性抑制率,以确定活性组分,并将其与阳性对照药别嘌醇进行XOD活性半数抑制率(IC50)比较.结果:乙酸乙酯提取物XOD活性抑制率最高,为(25.60±1.01)%;与其他各组比较,经50%乙醇纯化得到的活性组分XOD活性抑制率最高,为(60.90±1.27)%.与阳性药别嘌醇进行比较,通过测定尿酸生成量得出50%乙醇纯化得到的活性组分对XOD的IC50为6.00 mg·L-1,别嘌呤醇对XOD的IC50为1.10 mg·L-1;而通过测定超氧离子生成量得出50%乙醇纯化得到的活性组分对XOD的IC50为4.50 mg·L-1,别嘌呤醇对XOD的IC50为1.05 mg·L-1.结论:玉米须中抑制XOD的活性组分为经50%乙醇纯化得到的活性组分.
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(037)003noyes
【总页数】4页(P433-436)
【关键词】玉米须;痛风;黄嘌呤氧化酶
【作 者】姜彤伟;徐建;王晓明;陈雪松;邱智东
【作者单位】长春中医药大学药学院,吉林,长春,130117;吉林省修正药业集团,吉林,长春,130012;吉林大学第一医院心内科,吉林,长春,130021;吉林省创智医药开发有限公司;长春中医药大学药学院,吉林,长春,130117
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5;R589.7会计专升本考试科目
玉米须(Stigma madis)为禾本科玉蜀属植物玉米(Zea mays L.)的花柱，为《中华人民共和国药典》1977年版(一部)收录的常用药材品种[1]。玉米须主要含有黄酮类、多糖类及皂苷等成分[2]。据《中药大辞典》记载：玉米须水提取物对人或家兔均有利尿作用,可增加氯化
物排出量,作用较弱但是效果持久[3]。国内蒋一强等[4]在动物模型上研究玉米须及芭蕉芯提取液对肾草酸钙结晶形成具有抑制作用,玉米须提取液具有抑制实验性高草酸尿症小鼠肾脏草酸钙结晶形成的作用。口服玉米须对治疗膀胱炎，尿道炎，夜间遗尿症，前列腺炎，急、慢性泌尿系统炎症及痛风性关节炎有特效。Yesilada等[5]报道：玉米须具有抗炎、抗痛风等功效。但鲜有玉米须能够抑制黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxida,XOD)活性的报道。近年来研究发现：XOD是嘌呤代谢过程中的关键酶，有效抑制XOD活性可减少黄嘌呤向尿酸的转化,从而降低体内尿酸和超氧自由基的水平,达到治疗痛风的目的[6-7]。XOD的活性可以通过尿酸生成量和超氧阴离子的生成量来测定。本研究旨在通过建立XOD体外筛选模型，筛选出玉米须中抑制XOD活性的组分，为将其进一步开发成治疗痛风新的中药奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 玉米须采自吉林省长岭县，经长春市药检所鉴定为禾本科玉蜀属植物玉米的花柱。AB-8大孔树脂(南开大学化工厂)，氯化硝基四氮唑兰(美国Amresco公司)，黄嘌呤(美国Sigma公司)，XOD(美国Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。UV-9200型紫外-可见分光光度计 (北京瑞利分析仪器厂)，微量移液器(美国Thermo Electron公司)。
1.2 玉米须不同溶剂提取物的制备 玉米须5 kg，除去杂质，剪成段3～4 cm，用10倍量75%乙醇70～80 ℃回流提取4次，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇，加水溶解，依次用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇提取至无色。合并各部分提取液，回收溶剂，浓缩成稠膏，干燥，备用。
1.3 玉米须活性组分的制备 玉米须5 kg，除去杂质，剪成段3～4 cm，用10倍量75%乙醇70～80 ℃回流提取4次，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇，加水溶解，用乙酸乙酯提取至无色，回收溶剂，浓缩成稠膏，加水溶解，经AB-8大孔树脂柱分离，以水及10% 、30%、50%、70%、90%的乙醇洗脱纯化，回收各部分洗脱液，浓缩，干燥，备用。
1.4 黄嘌呤-XOD系统产生超氧离子的检测[8-10] 反应总体积3 mL,内含黄嘌呤0.15 mmol·L-1 、NBT 50 μmol·L-1、磷酸盐缓冲液50 mmol·L-1(pH值7.5)及不同浓度的提取物或阳性对照别嘌醇,25℃预热10 min，加入XOD起动反应,25℃反应5 min,以10 mmol·L-1盐酸为终止剂，于560 nm波长下测定吸光度(A560),每个样品平行操作3次。
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1.5 黄嘌呤-XOD系统产生尿酸的检测[8～11] 反应总体积3 mL,内含黄嘌呤0.15 mmol·L-1、
不同浓度提取物或阳性对照别嘌醇,25℃预热10 min，加入XOD起动反应,25℃反应5 min,以10 mmol·L-1盐酸为终止剂，于290 nm处测吸光度值(A290)，每个样品平行操作3次。
1.6 非酶体系产生超氧离子的检测[12] 邻苯三酚自氧化法在试管中加入pH值为8.2的Tirs-HCl缓冲液3 mL，于25 ℃恒温水浴中放置20 min，加入25℃预热的邻苯三酚溶液，自氧化速率控制在0.060～0.065 A·min-1。以5%维生素C溶液为终止剂，立即混匀，室温下放置5 min后，于420 nm波长下测吸光度值(A420)，每个样品平行操作3次。
1.7 XOD活性的计算 XOD活性可用抑制百分率表示:XOD活性抑制率= [1-(A供试品+AXOD)/A供试品]×100% 。
1.8 半数抑制率(IC50)的计算 以提取物(或别嘌醇)的浓度为横坐标，以其相对应的抑制百分率为纵坐标作线性回归，计算XOD活性抑制率为50%时的药物浓度，即IC50。
1.9 统计学分析 采用DAS 2.0 统计软件进行统计学处理,XOD抑制率以±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 玉米须不同溶剂提取物对XOD的抑制率 在相同药物浓度条件下比较乙醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水提取物对XOD产生尿酸及超氧阴离子的抑制率，乙酸乙酯提取物的抑制率最高，其抑制活性最强。见表1。祛斑美白方法
2.2 玉米须活性组分对XOD的抑制率 在相同药物浓度条件下比较经水及10%、30%、50%、70%、90%乙醇纯化得到的活性组分对XOD产生尿酸及超氧阴离子的抑制率，经50%乙醇洗脱纯化得到的活性组分的抑制率最高，抑制活性最强。见表2。
表1 玉米须不同溶剂提取物对黄嘌呤-XOD体系的抑制率Tab.1 The inhibitory rates of extraction of Stigmata maydis with different solvents on XOD (n=3,±s,η/%)Group Do(mg·L-1)Inhibitory rateUric acid Superoxide ion Ethylether extraction 6.345 5 —3.91±1.52Acetidin extraction 6.354 1 25.60±1.25∗ 27.20±1.22∗n-butanol extraction 6.357 4 12.50±1.01 14.40±1.45Water extraction 6.345 3 6.10±1.16 8.80±1.38* P<0.05 compared with other groups.
2.3 玉米须50%乙醇纯化活性组分与阳性对照药别嘌醇对XOD抑制活性的比较 通过尿酸生成法测定50%乙醇纯化得到的活性组分对XOD的IC50为6.00 mg·L-1,别嘌呤醇对XOD的IC
50为1.100 mg·L-1；而通过超氧离子生成法测定50%乙醇纯化得到的活性组分对XOD的IC50为4.50 mg·L-1,别嘌呤醇对XOD的IC50为1.05 mg·L-1,并且别嘌醇几乎没有清除超氧自由基的能力。见表3。
表2 玉米须活性组分对XOD酶活力的抑制率Tab.2 The inhibitory rate of active ingredient of Stigmata maydis on XOD activity (n=3,±s,η/%)Group Do(mg·L-1) Inhibitory rateUric acid Superoxide ionWater 6.354 2 19.00±1.44 15.90±1.7710% Ethanol 6.354 5 9.50±1.19 11.10±1.6430% Ethanol 6.357 2 14.20±1.08 12.70±2.0050% Ethanol 6.356 2 60.90±1.27∗70.30±1.31∗70% Ethanol 6.352 6 28.60±1.59 22.20±1.4890% Ethanol 6.351 7 33.30±1.10 46.00±1.39* P<0.05 compared with other groups.
表3 玉米须50%乙醇纯化得到的活性组分对XOD酶活力的抑制率Tab.3 The inhibitory rate of active ingredient of Stigmata maydis purified with 50% ethanol on XOD activity (n=3,±s)Group Do(mg·L-1) Uric acid Inhibitoryrate(η/%) IC50[ρB/(mg·L-1)]Superoxide ionInhibitoryrate(η/%) IC50[ρB/(mg·L-1)]Superoxide ion by non-enzyme systemInhibitoryrate(η/%) IC50[ρB/(mg·L-1)]50% Ethanol active ingredi-ent3.1016.202 12.
404 40.5 54.468.2 6.00 47.373.3 82.6 4.50 33.456.7 78.3 5.90 Allopurinol0.6161.2322.464 39.955.672.4 1.10 40.356.273.81.052.74.210.20.00
3 讨 论
有效组分的筛选是新药开发的重要途径,建立相应的筛选模型是发现药物的关键环节,而简单、高效的检测方法是药物筛选的基本要求。有效组分的筛选多依靠动物实验，而动物模型的建立则是药物筛选的瓶颈。为了打破造模对药物筛选的束缚，建立合理、有效、可靠的体外药物筛选模型是必不可少的。因此，本研究以XOD为作用靶点，建立了XOD抑制剂体外筛选模型，并通过运用该模型，首次发现玉米须中含有能够抑制XOD活性的组分。
目前,XOD活性检测方法有3种:①利用产物尿酸生成的紫外测定法；②利用其催化过程产生的O·-2 与电子受体及显色剂作用,生成紫红色结合物的比色法；③利用其产生的H2O2与NAD+或NADP+反应生成NAD (P) H的紫外或荧光检测法。但考虑到H2O2反应原理复杂及灵敏度较低,本研究选择检测反应产物中的尿酸及超氧阴离子,保证实验结果的可靠性。
本研究结果显示：通过尿酸生成法测定玉米须50%乙醇制得的活性组分对XOD的IC50为6.
00 mg·L-1,阳性对照别嘌呤醇的IC50为1.10 mg·L-1，通过超氧离子成法测定50%乙醇制得的活性组分对黄嘌呤氧化酶IC50为4.50 mg·L-1,阳性对照别嘌呤醇的IC50为1.05 mg·L-1，说明玉米须活性组分对XOD的抑制效果已经接近别嘌呤醇的抑制效果，若将玉米须活性组分再进一步纯化，其XOD活性的能力完全有可能达到甚至超过别嘌呤醇。noticeable
本实验结果也反映出玉米须活性组分要成为新型抗痛风药物还存在一定距离，需要更多的研究以明确玉米须纯化物在体内外降低尿酸水平的作用机制，同时分离出高纯度的抗痛风活性成分，这样才有可能提高药效，降低用药量。本研究结果为将玉米须开发成疗效好、毒副作用小的的纯中药新制剂奠定基础。
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【相关文献】
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社,1977.
[2]洪秋菊,任 远.玉米须的化学成分与药理研究[J].甘肃中医学院学报，2010,27(4):74-77.
