西北植物学报，2021 ,4 1 (5):0719 — 0726
Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.
doi ： 10. 7606/j. issn. 1000-4025. 2021.05. 0719
http ：//xlzwxb. alljournal. net
转HSSP 基因大豆的分子检测和
遗传稳定性分析
郭丹丹，周静文，刘洋，马晓飞，王思楠，樊荣，柏锡*
收稿日期：2021-02-19：修改稿收到日期：2021-04-16
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08004003)
作者简介：郭丹丹(1996—)女，在读研究生硕士，主要从事植物基因工程研究。E-mail ：1075725291@qq. com
*通信作者：柏 锡，教授，博士生导师，主要从事植物分子生物学和逆境生理学研究。E-nail ： **************. cn
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）
摘 要HSSP 是用大豆密码子改造的10kD 玉米醇溶蛋白基因。在前期研究中，从获得的转基因大豆中筛选到1
份单拷贝转基因材料GSDH5。该研究采用染色体步移法获取转基因大豆OSDH5的T-DNA 插入位点的左边界 旁侧序列，对获得的左边界旁侧序列进行分析，设计特异性引物，建立转基因大豆GSDH5特异性检测方法；采用
Real-time PCR 检测外源基因在转基因大豆不同组织部位（根、茎、叶、花和种子）中的表达量，采用RT-PCR 和
Western blot 检测外源基因在转录和翻译水平上的遗传稳定性，并对转基因大豆GSDH5中的粗蛋白、含硫氨基酸
含量及主要农艺性状进行测定分析，为培育高含硫氨基酸转基因大豆新品种奠定基础。结果表明：（1）分子鉴定显 示，外源基因HSSP 和筛选标记基因成功整合到受体大豆'东农50，基因组中，且以单拷贝的形式整合到大豆
基因组中。（2） H SS P 基因成功插入到大豆基因组1号染色体非编码区52 873 883 bp 处。（3） HS S P 基因在转基
因大豆GSDH5的种子中特异性表达，且在丁2〜丁4代转基因大豆中能够稳定遗传并表达。（4）东农50，粗蛋白含 量在4 1. 53%〜4 3. 32%之间，GSDH5粗蛋白含量在40. 18%〜43. 03%之间，两者相比无显著差异；GSDH5种子
中硫氨基酸占种子干样的比例为1.35%，占种子蛋白的比例为3. 14%，与转基因受体品种'东农50，相比，占比显 著升高，分别增加了 11%和16%。（5）转基因大豆GSDH5植株与受体品种'东农50，在单株荚数、百粒重、株高、结 荚习性、花色、叶形等方面均无显著差异，证明HSSP 基因的插入对大豆植株的生长发育无不良影响。研究认为,
转基因大豆GSDH5材料具备进一步培育成高含硫氨基酸大豆新品种的潜力。
lineup
关键词：大豆；含硫氨基酸；品质改良；转基因
中图分类号：Q786； Q789； S565. 1 文献标志码:A
Molecular Detection and Genetic Stability Analysis
of HSSP Transgenic Soybean
GUO Dandan , ZHOU Jingwen, LIU Yang , MA Xiaofei , WANG Sinan , FAN Rong , BAI Xi *
(College of Life Science , Northeast Agricultural University , Harbin 150030, China)
Abstract : HSSP is a 1 0 kD Zein gene modified with soybean codon. In the previous study, a single copy of
transgenic soybean GSDH5 was screened from the genetically modified soybeans. In this study, the left, boundary flanking quence of the T-DNA inrtion site of the transformation soybean GSDH5 was ob
tained by chromosome walking method , and the left boundary flanking quence was analyz
ed , the specific primersweredesigned ,andthespeciicdetection methodoftransformationsoybean GSDH5 wastab-
lished. Real-time PCR was ud to detect the expression of foreign genes in different, tissue parts of trans
720西北植物学报41卷
genic soybean(root.,stem,leaf,flower and ed),RT-PCR and Western blot,were ud to detect,the genetic stability of the target gene at the transcriptional and translation levels.The contents of crude protein,sulfur-containing amino acids and main agronomic characters in the transgenic soybean GSDH5were determined and analyzed,which laid a foundation for cultivating new varieties of transgenic soybeans with high sulfur amino acids.The results showed that.:(1)molecular identification showed that the exogenous gene HSSP and the screening marker gene Bar were successfully integrated into the soybean4Dongnong 50'genome,and were integrated into the soybean genome in the form of single copy.(2)HSSP gene was successfully inrted into52873883bp of non-coding region of soybean genome1.(3)HSSP gene was specifically expres
d in the eds of transgenic soybean GSDH5,and could be stably inherited and expresd in T2—T4transgenic soybeans.(4)The range of crude protein content of4Dongnong50'was 41.53%—43.32%,and that of GSDH5was40.18%—43.03%.There was no significant difference between the two.Sulfur amino acids in GSDH5eds accounted for1.35%of ed dry samples and3.14% of ed protein,which incread significantly by11%and16%,respectively.(5)There were no signiii-cant differences between transgenic soybean GSDH5plant and acceptor variety4Dongnong50'in pod number per plant.,100-ed weight,plant height,pod forming habit.,flower color,leaf shape and other aspects whichprovedthattheinrtionof HSSP genehadnoadvere f ectsonthegrowthanddevelop-ment of soybean plant.It.is suggested that the transgenic soybean GSDH5material has the potential to culivatenewsoybeanvarietieswithhighsulfuraminoacidcontent.
Key words：soybean；sulfur-containing amino acid;quality improvement;transgenic
大豆(Glycine mm)富含蛋白质和脂肪，是重要的粮食和油料作物。全世界约75%的大豆主要用于动物饲料口］是人类和动物主要的蛋白质来源。大豆氨基酸组成中含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸)相对不足，不利于单胃动物的生长和发育［2］。同时还可能降低动物对疾病的抵抗力。有研究表明，含硫氨基酸缺乏可能阻碍儿童的身心发育34。
富含硫的异源种子贮藏蛋白在转基因大豆中的表达可以改善大豆营养品质Kim等6将种子特异性菜豆卜菜豆蛋白启动子驱动的18kD玉米醇溶蛋白基因转入大豆中，使大豆种子中蛋氨酸和半胱氨酸含量增加12%〜20%。Li等7将27kD7-玉米醇溶蛋白基因导入大豆，使种子中的半胱氨酸含量从26.97%增加到29.33%，蛋氨酸含量从15.49%增加到1&57%。另外，将CGS基因转入拟南芥，使得种子游离蛋氨酸含量增加8-20倍［9］。10kD玉米醇溶蛋白富含含硫氨基酸，将其转入枯草芽胞杆菌益生菌中，能使菌体蛋氨酸含量提咼20.51%［10］。
培育的转基因作物新品种在商品化之前，对目的基因的整合和表达情况的检测是必不可少的。外源基因的旁侧序列是针对不同转化事件的唯一性标识，对研究转基因作物的遗传稳定性和转基因作物的产权保护、检测和监管均具有重要价值［1。在已知旁侧序列位置的基础上建立事件特异性检测方法是区分不同转化事件的高效准确检测方法。Fan等建立了针对旁侧序列和转基因的事件特异性方法，用于鉴定一个特定的转基因番木瓜株系。
韩庆梅等［12］研究了高蛋氨酸转AtD-CGS基因大豆后代植株的遗传稳定性。胡英迎等［13］对转精氨酸酶基因玉米进行遗传特性分析。Liu等［14］研究Bt融合蛋白Cry1Ab/Cry2Aj基因在转基因玉米事件ZD12-6中可在不同世代下稳定表达。
实验室前期将10kD玉米醇溶蛋白进行密码子改造，并融合大豆球蛋白2基因启动子，筛选标记基因为
Br，采用农杆菌介导法转入到受体品种，东农5(0中，获得大量转基因材料。本研究以筛选得到的单拷贝转基因材料GSDH5为试材，基于目的基因的旁侧序列确定其插入位置，并在基因水平、转录水平、翻译水平和性状表现等方面评价转基因大豆材料的遗传稳定性和性状表现，建立GSDH5的特异性检测方法，为培育高含硫氨基酸转基因大豆新品种奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
转基因大豆材料GSDH5由本实验室扩繁保存，受体品种'东农50，由东北农业大学大豆研究所提供。
1.2实验方法
田间试验分别于2018—2019年在东北农业大学转基因试验基地进行。对丁3、丁4代GSDH5及
5期郭丹丹，等：转HSSP基因大豆的分子检测和遗传稳定性分析721
'东农5(0采取正常密度人工点播，行距().5m，行长18m，每4垄为一个小区，转基因田间栽培管理按照《农业转基因生物安全评价管理办法》的要求进行。
1.2.1PCR检测提取基因组DNA参考黄宣等优化的CTAB法，根据HSSP基因序列设计正反向引物(5'-CAGGGTCTCGCTTCAC3^U5-GTCATAGCCATAGGGTTG3'),Bar基因序歹U 设计正反向引物(5-TGCCAGTTCCCGTGCTT-GAA-3'和5'-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3')进行基因组DNA分子检测。反应条件：94°C预变性1()min；94C变性30s,58C退火30s,72C 延伸20s,30个循环；72C延伸10min。
1.2.2Southern blot分析使用DIG DNA labeling and Detection Kit.(Roche)试剂盒，按照试剂盒说明书进行，验证目的基因HSSP在转基因植株基因组中的整合情况。
1.2.3RT-PCR检测采用康为世纪RNA提取试剂盒提取大豆的总RNA(方法参照说明书进行)，反转录采用反转录试剂盒进行,HSSP基因引物同1. 2.1,GmTUA5为内参基因，引物序列(5-AC-CACCAGGAACAACAGAAGG3'和5‘-TGCCAC-CATCAAGACTAAGAGG3')，反应条件同1.2.1。
1.2.4Real-time PCR检测按照TransStart Top Green qPCR Super Mix Kit(全式金生物)试剂盒说明书进行,HSSP基因引物同1.2.1，内参基因引物同1.2.3，反应条件：5C预变性30s；95C变性15s,60C退火15s,72C延伸15s,40个循环；95C变性30s；60C退火30s。以2aa<:'r算法计算HSSP基因的相对表达量。
1.2.5基因组插入位点分析使用限制性内切酶Dra I对基因组DNA进行完全酶切，连接Adpator 接头，建
立基因组DNA文库。以AP1/I1405为引物(GTAATACGACTCACTATAGGGC和CTG-CACCATCGTCAACCACTACAT)，进行文库第一轮扩增。以第一轮PCR扩增产物为模板,AP2/ 1997为弓I物(ACTATAGGGCACGCGTGGTC和CTGGCATGACGTGGGTTTCT)，进行第二轮扩增，直到得到单一条带，测序结果在NCBI网站(http：//bi.v)上进行Blast比对。反应条件：94C25s,72C3min,7个循环；94C 25s,67C3min,32个循环；67C7min。
根据测序获得的旁侧序列，在大豆基因组和外源T-DNA插入位点之间设计特异性检测引物GS-DH5-F(TCGTTTCCCGCCTTCAGTTT)和GS-DH5-R(GACAGCACAAAGAACGCAGC)，在插入T-DNA区前的大豆基因组序列上设计'东农50对照检测弓I物DN50-F(AGCACTGACCGAC-CAAATGT)和DN50-R(AACTGACTAACCCT-TCCGCA)，对GSDH5转化事件、其他转化事件及非转化事件进行PCR扩增。反应条件：94C预变性10min；94C变性30s,60C退火30s,72C延伸30s,30个循环；72C延伸10min。
1.2.6Western blot检测大豆籽粒研磨成粉末取0.1g于2mL EP管中，加入60%乙二醇，震荡混匀5min，水浴锅50C孵育1h提取种子醇溶蛋白,6000r/min离心10min，取上清液加入SDS上样缓冲液，煮沸变性5min。取上清液15“L于15%SDS-PAGE进行电泳，转至PVDF膜，进行Western blot检测，一抗为HSSP抗血清(1:500)，二抗为山羊抗兔IgG/HRP(1:2000)，滴加ECL化学发光液，化学发光仪显影0.1〜10s，拍照。
princess什么意思
1.2.7粗蛋白含量测定大豆籽粒粉碎后，委托中国农业科学院饲料研究所测定粗蛋白含量。
1.2.8含硫氨基酸含量测定大豆籽粒粉碎后，委托中国农业科学院饲料研究所测定含硫氨基酸含量，根据公式计算占种子干样及蛋白的比例。蛋氨酸/胱氨酸占种子干样/蛋白计算公式：
粗蛋白在干样中含量(Z)：Z=Y/(1—X/100)
蛋氨酸/胱氨酸占干样比例(B)：B=A/(1—X/100)
蛋氨酸/胱氨酸占蛋白比例(C)：C=B/(Z/100)
其中，A为蛋氨酸/胱氨酸占鲜样比例，Y为粗蛋白含量，X为含水量。
1.2.9农艺性状调查大豆成熟、收获后对转基因株系GSDH5和受体品种'东农5(0进行考种，调查主要的农艺性状。
1.3数据分析
采用Origin2018软件进行数据的处理与分析。2结果与分析
2.1转基因大豆GSDH5的分子检测
2.1.1PCR检测对T1代的GSDH5株系及受体品种'东农50，涂抹靶标除草剂草铵膦进行初步抗性筛选，对筛选后呈阳性的转基因大豆株系及受体品种'东农50，提取DNA进行PCR检测，阳性对照及转基因大豆均可扩增出263bp的目的基因部分片段(图1,A)和414bp的标记基因部分片段(图1,
722
西北植物学报41卷
100 bp
1 000 bp 750 bp
500 bp + 1
M 2 000 bp 250 bp
EcoR I Sac 1 IKpn 1
元旦快乐用英语怎么说
+ 1 2
2 000 bp 1 000 bp 750 bp
500 bp 250 bp
100 bp
■・01
A 、B. T 1代植株DNA 检测(M. DL2000): +.阳性质粒；一.东农50； A. HSSP 基因检测(1 — 8.转基因植株)；
B. Bar 基因检测(1 — 10.转基因植株)；C 、D. T 1代植株Southern blot 检测(M ‘. DL15000) ； C ： 1 — 2.东农50；3. Xba I 酶切产物；
4. Hind 酶切产物；D ：1. Xba I 酶切产物；2. Hind 酶切产物；3.东农50；E.转基因大豆GSDH5的T-DNA 区图谱
图1转H SS P 基因材料的分子检测
A and B. DNA detection of T 1 generation plants (M. DL2000) : +. Positive plasmid ；——. Dongnong 50 ； A. HSSP gene detection ： (1一8. Transgenic plants) ； B. Brr gene detection (1一10 transgenic plants) ； C and D. Southern blot detection of T 1 generation
plants (M ‘. DL15000). C : 1 — 2. Dongnong 50 ； 3. Xba I digestion product ； 4. Hind 川 digestion product.
D : 1. Xba I digestion product ； 2. Hind 川 digestion product ； 3. Dongnong 50. E. T-DNA map of transgenic soybean GSDH5
Fig. 1 Molecular detection of transgenic HSSP materials
R A E
U O I S S U J d x u
U A I
enowS —
900800
700600
500
400 a
SD
15
10
5
RT SM LF FR
组织 Tissues
RT.根；SM.茎；LF.叶；FR.花；SD.种子。不同小写字母表示
基因表达量在不同组织中有显著差异(P V0. 05)
图2 HSSP 基因在转基因大豆不同组织中的表达量
RT. Root ； SM. Stem ； LF. Leaf ； FR. Flower ； SD. Seed.Different normal letters indicate that there are significant differences
of gene expression levels among different tissues (P V 0. 05)
Fig. 2 Expression of HSSP gene in different
tissues of transgenic soybean
B ）受体品种，东农50，未能扩增出任何条带。结果
表明，外源基因HSSP 和筛选标记基因Br 成功整 合到大豆基因组中。
2.1. 2 Southern blot 检测 为了进一步证明外源 基因在大豆中的整合情况，确定外源基因的拷贝数,
根据转基因大豆GSDH5的T-DNA 区图谱（图1,
E ），选取Hid 川和Xba I 两种限制性内切酶, Br 基因和HSSP 基因两种探针，进行Southern
blot 检测。结果显示，经过酶切的转基因大豆基因
组DNA 和阳性对照与Br 基因探针/H SS P 基因 探针杂交后均出现了单一条带，而受体品种'东农
50，无杂交条带形成（图1,C 、D ）。证明外源基因
HSSP 以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。
lori
2.1.3 HSSP 基因种子特异性表达分析提取转
基因大豆不同组织部位根、茎、叶、花、种子的RNA,
利用Real-time PCR 检测外源基因H SS P 的表达 量，结果（图2）表明，在种子中HSSP 基因表达量
5期郭丹丹，等：转H SS P 基因大豆的分子检测和遗传稳定性分析723
显著高于根、茎、叶、花，证明外源基因H SS P 在转 基因大豆种子中特异性表达。
2.1.4 HSSP 基因插入位点分析 提取GSDH5 的基因组DNA，用Dra 1进行完全酶切，连接Ad-
ptr 构建GSDH5基因组DNA 文库。以AP1/ L1405为引物，进行文库第一轮扩增（图3,A ）。以
第一轮PCR 扩增产物为模板，AP2/L997为引物, 进行第二轮扩增，得到大约963 bp 单一条带（图3,十个月宝宝早教
versatilityB ）第二轮PCR 产物回收进行测序。将载体序列
去掉后，结果提交NCBI 数据库，在Glycine max
Wm 82. a 2. °1基因组数据中进行BLASTN 搜索
（图3, C ）。结果表明，该序列与1号染色体
52 873 248〜52 873 883 b p 匹配，并且落到了非编
码区域，确定了 T-DNA 区插入到大豆1号染色体 基因组的52 873 883 bp 处。
2.2 转基因大豆GSDH5遗传稳定性分析
2.2 1特异性PCR 检测 特异性引物设计在转基 因大豆GSDH5的外源T-DNA 序列和大豆基因组 之间，其他转基因材料和受体'东农50，不会扩增出 特异性条带，只有GSDH5能扩增出预期大小约395
bp 的片段。而对照引物设计在插入T-DNA 区前
的大豆基因组序列上，仅有受体'东农50，能扩增出
728 bp 的片段，转基因材料无法扩增出产物。证明
引物对GSDH5-F/GSDH5-R 可以特异性识别转基
因大豆GSDH5（图4,A ）。
2. 2. 2 RT-PCR 检测 采用 RT-PCR 检测 T 2、T 3 和T 4代转基因大豆中外源基因HSSP 和内参基因
TUA 5的表达量。结果（图4,B ）显示，在大豆籽粒
中，外源基因HSSP 在转录水平上稳定表达，且在
T2T 和T 4稳定遗传。
2.2.3 Western blot 检测 为检测外源基因在翻
译水平上的表达情况，从丁3、丁4代转基因大豆GS-
DH5的成熟籽粒中提取蛋白进行Western blot 检
测（图4,C ）,GSDH5在10 kD 左右出现杂交条带, 而非转基因大豆没有出现杂交条带，表明外源基因
HSSP 在翻译水平上稳定表达 。
综合上述结果表明，外源基因HSSP 在转基因 大豆中稳定表达，并且在丁2、丁3和T 4中稳定遗传。
2.3 转基因大豆GSDH5性状表现
2.3 1 转基因株系GSDH5的粗蛋白含量 测定
丁3、丁4代转基因大豆GSDH5和受体品种'东农50,
的粗蛋白含量。结果（表1）显示。在T 3代中，测得
'东农50，粗蛋白含量为43. 32%,GSDH5粗蛋白含 量为43.03%，变幅0.6%。T 4代中，东农50，粗蛋
prepared是什么意思
白含量为41 53%,GSDH5粗蛋白含量为40. 18%,
变幅3%。由于不同植株间粗蛋白含量不同，而蛋白
A 、B. GSDH5 基因组文库巢式 PCR 结果。M. DL2000；A. — 轮 PCR，引物对 AP1/L1405；B.二轮 PCR,
引物对AP2/L997；C .测序结果Blast 分析
图3 HSSP 基因插入大豆基因组旁侧序列分析licenmanager
A and B. Nested PCR results of GSDH5 genome library. M. DL2000 ； A. The first round of PCR, primer pair AP1/L1405 ；
B. The cond round of PCR, primer pair AP2/L997 ；
C. Blast analysis of quencing results
Fig. 3 Analysis of the flanking quence of HSSP gene inrted into soybean
genomelucky什么意思
