DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14123
大豆TGA转录因子基因GmTGA26在盐胁迫中的功能分析
柯丹霞*霍娅娅刘怡李锦颖刘晓雪
傲慢与偏见电影台词
信阳师范学院生命科学学院/ 大别山农业生物资源保护与利用研究院，河南信阳464000
摘要：TGA转录因子是bZIP的一个亚家族，在病原体和非生物胁迫反应中发挥重要作用。本研究在大豆中筛选并克隆得到1个TGA转录因子家族基因GmTGA26，同源蛋白比对表明GmTGA26具有保守的亮氨酸拉链结构域，与野生大豆同源性最高。基因表达特性分析表明，GmTGA26在大豆中受盐胁迫诱导表达。此外，GmTGA26编码核定位蛋白并且具有转录激活活性。通过发根农杆菌介导的大豆毛根转化，得到过表达GmTGA26的“复合体”大豆植株，在盐胁迫条件下，与空载体对照相比，“复合体”大豆植株生长状态更好，丙二醛含量和相对质膜透性明显降低(P < 0.05)，而叶绿素含量和根系活力则有显著的升高(P < 0.05)。qRT-PCR结果表明，盐胁迫条件下在大豆毛状根中过表达GmTGA26可显著上调胁迫响应基因的表达。以上结果表明，过表达GmTGA26显著增强了“复合体”大豆植株的耐盐能力。推测GmTGA26通过调控下游一系列胁迫响应基因从而参与调控大豆盐胁迫应激反应过程。
关键词: 大豆；TGA转录因子；毛根转化；耐盐性
Functional analysis of GmTGA26 gene under salt stress in soybean推荐
KE Dan-Xia*, HUO Ya-Ya, LIU Yi, LI Jin-Ying, and LIU Xiao-Xue
College of Life Sciences, Xinyang Normal University / Institute for Conrvation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang 464000, Henan, China
Abstract: TGA transcription factors are a subfamily of bZIP, which play important roles in pathogen and abiotic stress respons. A TGA transcription factor family gene GmTGA26was screened and cloned from soybean in this study. Homologous protein comparison showed that GmTGA26 had a conrved leucine zipper domain and had the highest homology with wild soybean. The analysis of gene expression characteristics revealed that GmTGA26gene was induced by salt stress in soybean. In addition, GmTGA26gene encoded nuclear localization protein and had transcriptional activation activity. The “complex” soybean plants overexpressing GmTGA26were obtained through Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation of soybean. The growth state of “complex” soybean plants was better t han the empty vector control under salt stress. Meanwhile, the MDA content and relative plasma membrane permeability decread significantly (P < 0.05), while the chlorophyll content and root activity incread significantly (P < 0.05). The qRT-PCR result
s indicated that overexpression of GmTGA26 in soybean hairy roots under salt stress could significantly up-regulate the expression of stress respon genes. The above results showed that overexpression of GmTGA26 significantly enhanced the salt tolerance of “complex” soybean plants. It is speculated that GmTGA26 participates in the regulation of soybean salt stress respon by regulating a ries of downstream stress respon genes.
Keywords: soybean;TGA transcription factor; hairy root transformation; saline tolerance
本研究由国家自然科学基金项目(U1904102)，河南省高等学校青年骨干教师培养计划和信阳师范学院“南湖学者奖励计划”青年项目资助。This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (U1904102), the Training Plan for Young Backbone Teachers in Colleges and Universities in Henan Province, and the Nanhu Scholars Program for Young Scholars of Xinyang Normal University.
*通信作者(Corresponding author): 柯丹霞, E-mail: kdx_
Received (收稿日期): 2021-07-14; Accepted (接受日期): 2021-10-19; Published online (网络出版日期): 2021-11-02.
kohURL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20211101.1200.010.html
大豆是我国乃至世界重要的油料、粮食和经济作物之一[1]。近年来，干旱、盐渍化、高温等非生物胁迫的发生频率逐年增加，严重影响了大豆的产量及品质[2]。尤其是我国盐碱地面积广阔，土地盐渍化问题严重。盐胁迫会明显抑制大豆的发芽率、营养积累、结瘤固氮等，最终导致大豆减产和品质下降[3]。因此，为解决大豆产量危机，提高大豆品质，发掘抗盐胁迫基因，培育大豆耐盐新品种显得尤为重要。
目前已经报道的大豆耐盐基因主要包括离子转运类基因和转录因子两大类。研究表明，在大豆中过表达Na+/H+交换系统NHX家族基因GmNHX1、GmNHX2和GmNHX5能够显著增强转基因大豆的耐盐能力[4-8]。质子/H+交换系统(CHX)家族基因GmSALT3通过降低大豆叶片中Na+的积累，从而提高大豆抗盐能力[9]。另一个CHX家族基因GmCAX1受盐胁迫诱导表达，在盐胁迫下可以提高转基因拟南芥种子的萌发率[10]。Cl−通道蛋白(CLC)家族基因GmCLC1能够通过调控Cl−的积累增强大豆的耐盐性[11]。高亲和性K+转运蛋白(HKT) GmHKT1和GmHKT4可以调节Na+和K+的平衡，增强转基因烟草的耐盐能力[12-13]。
转录因子(transcription factor, TF)在植物中广泛存在，当植物遭受逆境胁迫时，TF能够快速接收逆境反应信号，有效地调控植物抵御外界逆境胁迫，从而维持植物正常的生长发育[14-15]。MYB、ERF、WRKY、NAC以及bZIP类等TF家族中一些成员也被报道与大豆耐盐性相关。GmMYB12、GmMYB76、GmMYB92和GmMYB177在拟南芥中的异源表达能够提高转基因拟南芥的耐盐性[16-17]。
一对一英语中考在大豆中过表达GmMYB12B2、GmMYB84、GmMYB118和GmMYB174能够显著增加转基因大豆的抗盐能力[18-20]。GmERF75和GmERF135可以增强转基因拟南芥和大豆毛状根对盐胁迫的耐受性[21-22]。过表达GmWRKY12、GmWRKY49和GmWRKY111可以提高转基因大豆的耐盐能力[23-25]。在大豆毛状根中过表达GmNAC5、GmNAC11和GmNAC20可以提高大豆对盐胁迫的耐受性[26-27]。
bZIP (碱性亮氨酸拉链)转录因子是真核生物中一类高度保守的蛋白[28]。拟南芥中的75个bZIPs根据其序列相似性被分为10个亚家族：A、B、C、D、E、F、G、H、I、S[29]。这些亚家族成员参与调控逆境胁迫反应、细胞壁的形成及花粉的发育、种子成熟、锌离子调节、光诱导及光信号的感应、病原菌防御等过程[30-39]。TGA (TGACG motif-binding factor)转录因子属于bZIP家族D组成员[40]。烟草TGA1a是第一个从植物中克隆和鉴定的TGA转录因子基因[41]。随后在拟南芥基因组中陆续发现了10个TGA转录因子基因，共分为5组[42]。第Ⅰ组包括AtTGA1和AtTGA4；第Ⅱ组包括AtTGA2、AtTGA5和AtTGA6；第Ⅲ组包括AtTGA3和AtTGA7；第Ⅳ组包括AtTGA9和AtTGA10；第Ⅴ组是AtTGA8。其中，第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组主要参与抗病、抗逆反应[43-44]，第Ⅴ组主要参与调控花器官发育。TGA转录因子在拟南芥中的功能及调控机理已经研究得较为深入与透彻[45-48]。
Li等[49]在大豆(Glycine max)基因组中鉴定到27个TGA类转录因子，进化树分析表明27个TGA类转录因子位于进化树的3个分支上。分支I和II都含有8个GmTGA，而分支III有11个GmTGA。应用qRT-PCR
sciencefiction技术筛选出7个盐胁迫应答基因，其中，GmTGA5和GmTGA7的转录水平在盐处理时明显降低，GmTGA10、GmTGA13、GmTGA14、GmTGA17和GmTGA26的转录水平在盐处理时明显升高，尤其是GmTGA13升高了10倍，GmTGA17升高了26倍，GmTGA26升高了8倍。研究人员以GmTGA17为研究对象，揭示了GmTGA17在调控植物干旱和盐胁迫反应中发挥重要作用。李红丽等[50]根据拟南芥AtTGA1和AtTGA4蛋白氨基酸序列，在大豆中克隆得到1个GmTGA基因。研究表明GmTGA不具有转录激活活性，对NaCl、水杨酸(salicylic acid, SA)、PEG等非生物胁迫具有一定的响应。根据Li等[49]对大豆TGA家族的基因命名可知，该GmTGA基因为GmTGA23。已有研究表明，大豆TGA家族基因GmTGA17和GmTGA23在非生物胁迫反应中发挥重要作用，但是有关其他TGA家族基因的功能研究目前未见报道，本研究以GmTGA26为研究对象，通过揭示其在盐胁迫应答反应中的功能及可能的分子调控机制，为非生物胁迫下大豆TGA 转录因子的功能分析提供新的思路，也为后续作物品种改良提供新的有效的候选基因。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
栽培大豆(Williams 82)种子在湿润的蛭石中萌发生长，光照培养箱参数设置为温度25℃，相对湿度65%，16 h光照/8 h黑暗。挑选长势一致的V1期(第一复叶期)幼苗分为4组，每组21株，3次重复。将
幼苗移至含有100 μmol L–1脱落酸(ABA) (索莱宝，北京)的1/2 Hoagland培养液中进行外源脱落酸处理；将幼苗移至含有100 mmol L–1 NaCl (索莱宝，北京)的1/2 Hoagland培养液中进行盐胁迫处理；将幼苗移至含有30% PEG-6000 (索莱宝，北京)的1/2 Hoagland培养液中进行干旱处理；另外1组幼苗移至1/2 Hoagland培养液中，于4℃培养箱中进行冷胁迫处理。每组处理均在相同时间点取样，取样时间依次为：胁迫前0 h、胁迫后3、6、12、24、48和72 h，共7个时间点，每个取样点设置3次重复，收集幼苗的根部组织，液氮速冻后于-80℃冰箱放置备用。
1.2 GmTGA26基因在不同非生物胁迫条件下的表达检测
根据SoyBa网站公布的GmTGA26序列(Glyma20G113600)，利用Primer 5.0软件设计qRT-PCR引物GmTGA26-qRT (表1)。参照MiniBEST植物RNA抽提试剂盒(TaKaRa)说明书，提取W82大豆根的总RNA。参照TaKaRa公司反转录和荧光定量试剂盒操作说明进行基因表达水平的检测，使用BIO-RAD伯乐实时荧光定量PCR仪(CFX96，美国)进行试验。以大豆肌动蛋白11 (ACTIN11)为内参基因，利用相对定量法(2-∆∆Ct)公式计算基因的相对表达水平，Microsoft Excel分析数据并绘图。技术重复和生物学重复各3次。
表1 基因表达分析和载体构建所使用的引物
Table 1 Primers ud for gene expression analysis and vector construction
引物名称Primer name
正向引物
Forward primer (5′-3′)
反向引物
Rever primer (5′-3′)
中餐介绍GmTGA26A TGGCTGACGCCAGTCCTA TCAGTCTCTTGGGCGGG
GmTGA26-OE CGGGA TCCATGGCTGACG GGGGTACCTCAGTCTCTTGGGC
GUS GTCGCGCAAGACTGTAACCA CGGCGAAATTCCA TACCTG
GmTGA26-qRT GGAGCAACAGTTAGTGGGTATCAC CTTCCA TGCCCTGAGACAAAGC
ACT11-qRT GAGCTATGAATTGCCTGATGG CGTTTCATGAATTCCAGTAGC
GmDHN15-qRT TTTTGTTTTGTTGTATTGTGTAG GAAAAATCCTCCACCTGACGA
GmWD40-qRT TGCCAGTCTCGTTAGGCTTTTC CTTATTGAGTTGTTGTTTGGCAG
GmMYB48-qRT AACAACACTCTTCAGCCAGTTT GGGCAAAACAAACTTTCCTCAT
GmGST1-qRT CACAATGAGCAGCCCA TAGCA CTTCAACATTCTTCTCACGCTCT
GmLEA-qRT GGTGGGTGAAACCGCACAAGA A TGGATGCCGCCACTCCGCCAG
GmNHX5-qRT GTCTGGGTTCAGTCTCGCAC A TCAGAAAGAGCAAGCCACCA
GmSOS1-qRT TTGTGCTGCATTTCTTCGAG CGTGCTTCTTCTCCTTCCAC
1.3 GmTGA26基因的亚细胞定位和转录活性检测
扩增去掉终止密码子的GmTGA26的开放阅读框(open reading frame，ORF)区段，并将其融合到GFP 的N端区域。编码核定位蛋白的NtTGA2.2 (AAF06696)的ORF被克隆到RFP的N末端区域作为阳性对照[51]。基因由CaMV35S启动子驱动。将重组质粒NtTGA2.2-RFP和GmTGA26-GFP共转化到拟南芥原生质体中，以NtTGA2.2-RFP和35S::GFP载体共转化为对照。在22℃黑暗中培养16 h后，通过共聚焦显微镜检测荧光信号。
为在酵母细胞中进行转录活性测定，采用酵母金系统(Clontech)进行酵母双杂交试验。首先扩增GmTGA26的ORF，将其分别克隆到BD载体pGBKT7和AD载体pGADT7中，然后将诱饵质粒BD-GmTGA26转化到Y2HGold酵母菌株中，将文库质粒AD-GmTGA26转化到Y187酵母菌株中。2种不同的酵母菌株在三角瓶中配合，30℃、30~50转min-1缓慢摇动20~24 h。将配合后的酵母细胞分别涂布在二缺培养基DDO (SD/-Leu/-Trp)、DDO/X/A (含有125 ng mL–1 Aureobasidin A和40 μg mL–1 X-α-gal)和四缺培养基QDO (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)上，30℃培养2 d。BD-53/AD-T作为阳性对照，BD-Lam/AD-T作为阴性对照。
1.4 大豆毛根转化及阳性毛根鉴定
参照MiniBEST植物RNA抽提试剂盒(TaKaRa)说明书，提取W82大豆根的总RNA。参照TaKaRa公
司反转录试剂盒操作说明合成cDNA第一链。根据SoyBa网站公布的GmTGA26序列(Glyma20G113600)，用Primer Premier 5.0软件设计过表达引物GmTGA26-OE (表1)进行PCR扩增。将克隆得到的GmTGA26序列插入植物表达载体p1301U中，构建p1301U-GmTGA26大豆过表达载体，经酶切和测序验证后，将重组质粒经冻融法转入发根农杆菌菌株K599中，用于大豆的毛根转化[52]。取播种后生长4~5 d的大豆幼苗，用无菌针头刺破幼苗下胚轴靠近子叶节处，在伤口处涂上活化好的菌体。侵染后的大豆幼苗移栽到含大豆全氮营养液的水培盆中，前5 d需覆盖保鲜膜，并在下胚轴
伤口处喷无菌水使保持湿润。待伤口处形成愈伤组织后(4~5 d)可通氧。大约2~3周后可形成转基因毛根。每棵植株选取4条毛根分别系上不同颜色的细线，取侧根进行GUS染色[53]，经GUS染色显蓝的阳性毛根再提取DNA进一步进行PCR验证，最终每株留下2个生长状态较好的阳性毛根，用于后续抗盐表型鉴定。
1.5 “复合体”大豆植株的盐胁迫处理
毛根鉴定1周后，选取生长状态一致的“复合体”大豆植株进行盐胁迫处理，分别将空载体对照植株(EV)和超表达植株(OE)分为3组，每组24株浸泡在含有0、100、200 mmol L–1 NaCl的全氮水培溶液中处理1周。之后观察记录表型并测定相关生理指标。此外，每组不同处理的样品中随机挑选3株植株，剪取根部组织，液氮速冻后于-80℃冰箱储存，用于检测GmTGA26及胁迫响应基因的表达水平。设置3个重复。1.6 相关生理指标的检测
盐胁迫处理1周后，参考文献中的具体步骤[54]测定叶绿素含量、叶片质膜透性、丙二醛含量以及根系活力。采用全自动根系扫描分析仪(WinRHIZO)测量植株总根长。将盐处理1周后的植株从茎的第一个节点处剪开分为地上部和根部，分别放入信封中，70℃烘箱放置1周以上，称取植株地上部以及根部干重。
1.7 胁迫相关基因的表达分析
收集盐处理1周后的大豆毛状根进行qRT-PCR试验，引物见表1。利用相对定量法(2-∆∆Ct)公式计算100 mmol L–1 NaCl处理条件下，5个非生物胁迫反应基因GmMYB48、GmWD40、GmDHN15、GmGST1和GmLEA 以及2个大豆抗盐基因GmNHX5和GmSOS1在GmTGA26过表达毛状根中的表达水平。EV对照毛状根作为阴性对照，以大豆肌动蛋白11 (ACTIN11)为内参基因，技术重复和生物学重复各3次，Microsoft Excel 分析数据并绘图。
2 结果与分析
2.1 GmTGA26与同源蛋白的序列比对及进化树分析
将大豆GmTGA26蛋白与另外12种豆科植物的同源蛋白进行保守结构域序列比对发现，该类蛋白在不同物种中都有高度保守的亮氨酸拉链结构域LZ。GmTGA26蛋白与野生大豆(Glycine soja)、密花豆(Spatholobus suberectus)等物种的氨基酸序列相似性较高(图1-A)。
选取与GmTGA26基因编码的氨基酸序列相似性较高的几种豆科植物的TGA蛋白进行进化树分析。结果表明，大豆GmTGA26蛋白与野生大豆(Glycine soja)亲缘关系最近，其次是密花豆(Spatholobus suberectus)，与狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)的亲缘关系较远(图1-B)。
图1 GmTGA26与同源蛋白的序列比对及进化树分析维品网
Fig. 1 Sequence alignment and phylogenetic tree analysis of GmTGA26 and its homologous proteins
A：GmTGA26与其他植物中同源蛋白的保守BRLZ (碱性亮氨酸拉链区)结构域比对分析；B：GmTGA26及其同系物的系统发育树。比例尺代表遗传距离，表示物种间的邻近关系。
A: the conrved BRLZ (basic region leucin zipper) domain alignment analysis of GmTGA26 and its homologous proteins in some other plants. B: phylogenetic tree of GmTGA26 and its homologs. The scale reprents genetic distance, indicating the proximity relationships among species.
2.2 GmTGA26基因在不同非生物胁迫下的表达特征分析
分别检测4种不同胁迫处理下GmTGA26基因在大豆根中的表达情况发现，GmTGA26基因的表达同时受到ABA、高盐以及冷胁迫的诱导，在不同处理时间基因表达水平呈现不同程度的变化。由图2可知，高盐条件下基因表达水平的增幅尤为显著，在处理3 h时达到顶峰，为胁迫前的7.7倍。ABA与冷胁迫处理时，GmTGA26基因的表达量变化相对缓和，在出现小幅升高后逐渐下降，至处理24 h时回落到胁迫前的表达水平。而干旱处理时，该基因的表达水平并未出现明显变化。由此推测GmTGA26可能在盐胁迫应答反应中发挥更为重要的作用，因此我们下一步重点考察GmTGA26基因在盐胁迫下的生物学功能。
www bingdi com图2 不同非生物胁迫下GmTGA26基因的表达分析
Fig. 2 Relative expression analysis of GmTGA26 gene under different abiotic stress treatments
*、**分别表示在0.05和0.01水平差异显著。* and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.
2.3 GmTGA26蛋白的亚细胞定位及转录活性分析
加班英语
为研究GmTGA26蛋白的亚细胞定位，将GmTGA26的ORF与GFP融合，以NtTGA2.2融合到RFP 为阳性对照，将融合载体转化到拟南芥原生质体中，激光共聚焦显微镜观察荧光发现，GmTGA26-GFP蛋白仅在细胞核中检测到荧光；而空载体对照GFP蛋白在整个细胞中都有荧光(图3-A)。表明GmTGA26是一种核蛋白，这一发现与它作为转录因子的假定功能是一致的。
英国历史简介由于GmTGA26属于转录因子的成员，因此本研究采用酵母双杂交方法来分析GmTGA26是否具有转
