作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(3): 565 571 zwxb.chinacrops/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************
本研究由国家自然科学基金项目(32001508, 31930083, 31801384)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32001508, 31930083, 31801384).
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通信作者(Corresponding author): 程群,E-mail:*********************
第一作者联系方式:E-mail:*******************
Received (收稿日期): 2021-01-19; Accepted (接受日期): 2021-06-16; Published online (网络出版日期): 2021-07-13. URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20210712.1630.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14011
利用Ln 位点进行分子设计提高大豆单荚粒数
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五一英语作文杜 浩1 程玉汉2 李 泰1 侯智红1 黎永力1 南海洋1 董利东1 刘宝辉1 程 群1,*
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广州大学生命科学学院, 广东广州 510006; 2
北京市通州区潞城镇北京中农富通园艺有限公司, 北京 100083
摘 要: 分子设计育种是将分子遗传学与传统育种相结合, 并培育成具有优良性状的新品种的重要方法之一, 尽管该方法很大程度上能够缩短育种进程, 但在实际育种过程中却应用较少。在大豆的育种过程中, 提高产量是主要的育种目标之一, 其中, 每荚粒数是决定大豆单株产量的关键性状之一。在大豆中, 每荚粒数与叶片形状呈正相关, 由一对等位基因Ln /ln 控制, 宽叶的大豆品种一般为Ln , 窄叶的大豆品种一般为突变型ln , 且ln 伴随着更多的四粒荚。尽管Ln 对于大豆单产的提高, 具有潜在的重要作用, 但将该位点应用于分子设计育种中, 报道较少。本研究通过分析483份来自不同纬度大豆品种的Ln 基因型发现, 高纬度地区大豆品种一般为ln , 而低纬度地区大豆品种一般为Ln 。通过调查来自不同纬度的8个大豆品种的叶型和一粒荚至四粒荚个数发现, 低纬度大豆品种均为圆叶品种, 且几乎没有四粒荚。为将ln 应用于低纬度地区大豆育种中, 成功开发了Ln 的分子标记, 并通过连续回交的方法, 将ln 代换到圆叶型品种Willams 82和华夏3号中, 获得了四粒荚较多的大豆新材料。本研究利用大豆分子设计育种的手段, 提高了大豆单株产量, 为加快大豆高产育种进程提供了重要的理论及实践基础。 关键词: 大豆; L
n ; 产量; 单荚粒数; 分子设计
traffic lights什么意思Improving ed number per pod of soybean by molecular breeding bad on Ln locus
DU Hao 1, CHENG Yu-Han 2, LI Tai 1, HOU Zhi-Hong 1, LI Yong-Li 1, NAN Hai-Yang 1, DONG Li-Dong 1, LIU Bao-Hui 1, and CHENG Qun 1,*
1
School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, Guangdong, China; 2 Beijing International Urban Agricultural Science and
Technology Park, Zhong-Nong-Fu-Tong, Beijng 100083, China
Abstract: Molecular design breeding is one of the important methods to combine molecular genetics with conventional breeding, and to breed a ries soybean variety with excellent traits. Although this method can shorten the breeding process to a large extent, it is rarely ud in the artificial breeding process. Increasing production is one of the most important goals in the process of soy-bean breeding. Soybean is a typical short-day bean plant, which provides more than a quarter of plant protein for human and ani-mals in the world. In the process of soybean breeding, increasing the yield
is one of the main breeding objectives, among which the number of eds per pod is one of the key traits to determine the yield per plant. In soybean, the number of eds per pod was positively correlated with leaf shape, which was controlled by an allele Ln /ln . The broad leaflet (Ln ) usually linked with no 4-ed pod, and narrow leaflet (ln ) associated with 4-ed pod. Although Ln was potentially important for soybean yield, whether this locus could be ud in molecular breeding had not been reported. In this study, we found that the narrow leaflet variety was al-ways in high latitude, and the broad leaflet variety in low latitude. To improve soybean yield in low latitude, we developed the molecular marker of Ln . ln was substituted into broad leaflet varieties Willams 82 and Huaxia 3 by backcrossing. Our data provide an important theoretical and practical basis for molecular design breeding to improve soybean yield. Keywords: soybean; Ln ; yield; the number of eds per pod; molecular design
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566作物学报第48卷
分子设计育种是现代育种的重要方法之一, 主要通过将分子生物学与传统的育种相结合, 并培育出具有优良性状的新作物品种的方法[1-4]。传统的作物育种, 是通过将不同性状的亲本进行杂交, 在后代个体
中, 通过表型观察, 筛选优良个体, 并反复与亲本进行回交, 最终筛选出具有优良性状的新品种的方法, 然而, 该方法具有较高的盲目性, 耗费时间较长, 育种效率较低等缺点[1-4]。近年来, 随着目前高通量测序技术的快速发展, 精细定位, 全基因组关联分析及同源基因功能验证技术的产生, 有大量株高[5-6]、粒型[7]、开花[8-11]、逆境响应[12]等重要农艺性状的关键基因被挖掘出来。例如, Lu等[8]通过全基因组关联分析, 精准挖掘到大豆开花关键基因Tof11和12, 并证明这对同源基因能够通过延迟大豆开花, 提高大豆的单株产量。分子设计育种是利用与目标性状连锁的单个, 或者多个基因进行DNA分子标记, 定点对后代个体进行基因型检测, 能够减少目标性状选育过程中的盲目性, 从而达到对产量, 品质以及抗性等多种性状综合起来的高效改良, 大大提高了育种效率, 由此可见, 分子设计育种在作物的品种选育及改良中具有明显优势[4]。
栽培大豆起源于我国的黄淮海地区, 具有较为丰富的大豆种质资源[13-14]。随着近年来我国对大豆需求量的不断攀升, 大豆产量却供不应求, 严重依赖于进口, 因此, 提高大豆的耕种面积和提高大豆的单株产量至关重要[13-14]。大豆的每荚粒数是重要的产量性状, 大豆品种中一般具有一粒荚、二粒荚、三粒荚和四粒荚, 不同的品种中其比例并不相同[15]。在大豆中, 每荚粒数与叶片形状是连锁性状, 尖叶一般具有较多的三粒荚和四粒荚, 而圆叶一般具有较多的二粒荚和三粒荚[15-18]。Jeong等[16]将尖叶品种Sowon与圆叶品种V94-5152杂交后, 通过精细定位发现该连锁性状是由一对等位基因Ln/ln控制的, 随后, Fang等[15]通过将三粒荚较多的大豆品种Han2296和四粒荚较多的大豆品种Lübaoshi进行杂交后, 也得出了相同的结论。
Ln是拟南芥JAGGED (JAG)在大豆中的同源基因GmJAGGED1 (Glyma20g25000) [16]。GmJAGGED1属于锌指蛋白家族的成员, 是植物中特有的转录因子[17-18]。在拟南芥中, jag突变后, 能够降低细胞的分裂速度, 从而导致叶片形状发生改变[19]。在大豆中, GmJAGGED1的第2个外显子上产生了1个变异, 由碱基G变成C, 氨基酸由Asp置换为His, 因此导致不同的大豆品种叶片形状和每荚粒数不同[15]。Ln 的近等基因系表型观察发现, NIL-Ln一般具有较多的三粒荚和二粒荚, 而NIL-ln中则具有较多的四粒荚和三粒荚, 说明Ln是重要的每荚粒数控制基因[15-17]。尽管Ln已被成功克隆出来, 并且具有提高大豆单株产量的潜力, 但是将其应用于育种研究中, 相关报道较少。
我国大豆主要种植于高纬度地区, 如东北、黄淮海等地区, 低纬度种植地区较少, 而我国大豆却主要从巴西、阿根廷等低纬度国家进口, 因此, 提高低纬度地区的大豆种植面积, 以及低纬度大豆的单株产量是非常重要的[20-21]。本研究通过将黑河43 (ln)分别与Willams 82 (Ln)和华夏3号(Ln)进行杂交, 并定点筛选纯合ln的基因型后, 进行连续回交, 最终获得Willams 82和华夏3号背景下的较多四粒荚大豆材料, 该项研究利用分子生物学理论与大豆传统育种相结合的方法, 提出了具体实施的方案, 为进一步加快育种进程, 提高育种效率等工作提供指导意义。
1材料与方法
1.1材料
分别选取高纬度地区黑龙江省第一、二积温带主栽大豆品种绥农14 (SN14, 高油高产, 尖叶)和绥农88 (高产高蛋白, 尖叶); 黑龙江省第三积温带代表性的小粒豆品种东农50 (DN50, 高蛋白, 尖叶)和黑龙江省第四积温带主栽大豆品种黑河43 (HH43, 高产高蛋白, 尖叶); 适合中高纬度地区种植的大豆品种为Williams 82 (W82, 参考基因组测序品种, 圆叶); 低纬度地区优良大豆品种华夏3号(HX3, 高产, 圆叶), 华夏5号(HX5, 高产高蛋白), BR21 (巴西主栽大豆品种, 圆叶); 均由广州大学分子遗传与进化创新研究中心保存。
1.2Ln的单倍型分析
使用Lu等[8]424份和Fang等[22]871份大豆材料重测序数据和不同品种的地理分布数据, 利用Linux系统, 对Ln在不同的大豆品种中的基因型进行分析, 并统计其中分布在中国的483份栽培大豆中Ln的基因型。利用R软件, 将不同的基因型分布在中国不同地区的信息进行可视化。
velo1.3Ln分子标记设计
在Phytozome12 (phytozome.v/ pz/portal)数据库中下载Ln的DNA序列, 并通过
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第3期杜浩等: 利用Ln位点进行分子设计提高大豆单荚粒数 567
DNAMAN软件进行比对, 找到Ln的关键变异位点的位置, 利用Primer 5软件, 设计CAPs引物, 引物序列为Ln-CAPs-F: 5'-CGAGACCCACTGTCCAATT ATTCA-3'和Ln-CAPs-R: 5'-GAAGGGGCCCTCTCG ATGAT-3'。由广州天一辉远测序服务公司合成引物。以不同Ln基因型的DNA为模板, 进行PCR扩增, 目的片段使用限制性内切酶Bgl II进行酶切, 酶切后, 使用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.4大豆材料的表型观察
将不同纬度的大豆品种种植于花盆中(草炭土∶蛭石=2∶1), 每盆种植2棵, 每个品种种植4盆, 并在温室中进行培养, 光照为16 h光/8 h暗, 湿度为60%。当第2对三出复叶完全展开后, 每株植株取1对三出复叶, 进行叶片表型调查, 统计每片叶片的长宽比例。
将不同纬度的大豆品种种植于广东省广州市从化区田间, 自然光照, 温度下生长, 大豆品种成熟后, 每个品种选择10株植株, 分别调查每株植株的一粒荚、二粒荚、三粒荚、四粒荚、五粒荚个数, 取平均值进行统计。
1.5连续回交
以W82和HX3为母本, HH43为父本进行连续回交, 在每一次回交的过程中, 使用Ln分子标记对获得的杂交果进行鉴定, 将鉴定回交成功的杂交果种下去, 继续进行回交, 回交4次后自交一次, 并使用Ln的分子标记对后代个体进行筛选。筛选到纯合ln个体后, 进行表型观察与统计。
将W82、W82-ln突变体、HX3-ln突变体和HX3种植于广东省广州市从化区实验田间, 自然光照、温度下生长, 大豆植株成熟后, 分别调查不同背景下ln突变体, 以及W82和HX3的叶片形状和一粒荚、二粒荚、三粒荚、四粒荚、五粒荚个数。
1.6植物的DNA提取
参照DNA试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司, 中国)说明书使用方法, 提取不同大豆品种籽粒的基因组DNA, 具体流程如下: (1) 钻取少量大豆粉末于离心管中, 加入400 μL buffer LP1和6 μL RNa A, 振荡1 min, 放置10 min; (2) 加入130 μL buffer LP2, 混匀并振荡1 min; (3) 12,000⨯g离心5 min, 收集上清于新的离心管中, 加入1.5倍体积的buffer LP3 (已加入乙醇), 充分混匀; (4) 将上步所得溶液和沉淀全部加入到已装入收集管的吸附柱中, 12,000⨯g离心1 min, 倒掉废液并将吸附柱放回收集管中; (5) 向吸附柱中加入500 μL buffer GW2 (已加入乙醇), 12,000⨯g离心1 min倒掉废液并将吸附柱放回收集管中; (6) 12,000⨯g离心2 min, 倒掉收集管中的废液, 打开吸附柱, 室温放置数分钟, 以彻底晾干吸附柱中残留的乙醇; (7) 将吸附柱放入新的离心管中, 向吸附膜的中间位置悬空滴加50 μL buffer GE, 12,000⨯g离心1 min, 收集DNA溶液, -20℃保存。
2结果与分析
2.1Ln不同单倍型的地理分布
Ln是控制大豆叶片形状和每荚粒数的关键基因, 由GmJAGGED1 (Glyma20g25000)编码, 为解析Ln不同单倍型之间的地理分布, 本研究使用Lu 等[8]和Fang等[22]重测序的1295份大豆品种中483份主要分布在中国的栽培品种, 对该基因进行单倍型分析。根据Fang等[11]的研究表明, GmJAGGED1在编码区存在一个SNP, 当第2个外显子为G时, 为Ln; 当同一位置为C时, 为ln, 以此为根据, 对具有Ln不同基因型的483份的栽培大豆, 进行地理分布分析, 结果表明, Ln一般分布在低纬度地区, 而ln一般分布在高纬度地区(图1-A)。对204份来自HR (黄淮海地区)、168份来自NR (北部地区)、5份来自SR (南部地区)的Ln不同等位变异发生的频率进行分析发现, Ln的比例分别为94.6%、91%、100%, 而在纬度相对较高的NE (东北地区)地区的106份大豆品种中, ln的比例显著增高(图1-B), 说明在大豆驯化过程中, 不同纬度之间对于Ln的选择并不相同。
2.2不同纬度大豆品种的叶片表型分析
分别在高纬度东北地区选择4个代表性大豆品种, 在低纬度华南地区选择2个主栽大豆品种, 同时选取一个适合低纬度地区种植的巴西主栽大豆品种BR21和适合中高纬度地区种植的参考基因组测序品种Williams 82, 首先对其叶片表型进行观察, 发现高纬度地区种植品种DN50、SN14、HH43、SN88的叶片为尖叶(图2-A), 而低纬度地区种植品种HX3、HX5、BR21和W82的叶片圆叶(图2-B)。对叶片的长宽比进行统计发现, DN50、SN14、HH43、SN88的叶片长宽比均大于2, 而HX3、HX5、BR21和W82叶片的长宽比均接近于1, 显著小于4个高纬度地区大豆品种, 说明叶片形状与Ln的分布规律相符。
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作 物 学 报 第48卷
图1 Ln 不同等位变异的地理分布
Fig. 1 Geographical distribution of different alleles of Ln variation
A: Ln 不同等位变异在中国的地理分布图; B: 在不同地区, Ln 不同等位变异的分布频率。HR 代表黄淮
海地区, NR 代表北部地区, SR 代表南部地区, NE 代表东北地区。
A: the geographical distribution of Ln variation in China, red for Ln , blue for ln ; B: the allele frequency of Ln in different regions. HR: Huanghuai region; NR: Northern region; SR: Southern region; NE: Northeast region.
图2 不同大豆品种的叶片表型观察与统计
Fig. 2 Leaf phenotypes of different soybean varieties
A: DN50、SN14、HH43、SN88的叶片表型, 黄线代表C 中调查长宽比所测量的叶片宽度, 红线代表调查长宽比所测量的叶片长度; B: HX3、HX5、BR21和W82的叶片表型, 标尺为1 cm; C: 不同叶片的长宽比统计。
A: the phenotype of DN50, SN14, HH43, SN88 leaves, the yellow lines reprent the leaf width and the red lines reprent the leaf length; B: the phenotype of HX3, HX5, BR21, and W82 leaves; bar: 1 cm; C: the length-width ratio of different leaves.
2.3 不同纬度大豆品种的每荚粒数分析
南非前总统曼德拉
为进一步统计叶片形状与每荚粒数之间的关系, 对上述8个不同大豆品种的一粒荚至五粒荚个数进行统计, 结果显示, DN50、SN14、HH43、SN88的三粒荚和四粒荚数目较多, 而HX3、HX5、BR21和W82主要为较多的三粒荚和二粒荚, 几乎没有四粒荚, 说明尖叶与较多的每荚粒数呈正相关, 也说明低纬度地区的大豆品种, 对于提高单株产量, 具有较大的改良空间(表1)。
2.4 Ln 的分子标记开发
为进一步将Ln 基因应用于改良低纬度地区大
豆品种的每荚粒数性状中, 我们开发了Ln 的分子标记。如图3-A 所示, 能够被Bgl II 限制性内切酶切开的为Ln , 不能够被切开的为ln , 具有3条带的为杂合型。为进一步验证分子标记的准确性, 分别以上述8个品种的DNA 为模板, 对Ln 的基因型进行检测。结果显示, DN50、SN14、HH43、SN88中Ln 均不能够被酶切开, 说明这些品种中是ln , 而HX3、HX5、BR21和W82中Ln 均能够被切开, 说明这些品种中均为Ln (图3-B)。将W82和HX3分别与HH43进行杂交后, 对杂交果进行检测发现, 2个杂交果均为杂合型, 证明该杂交试验成功。
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第3期杜浩等: 利用Ln位点进行分子设计提高大豆单荚粒数 569
表1一粒荚至五粒荚数目统计
Table 1 Number of pod from 1-ed to 5-ed
品种名称Cultivar
distance一粒荚个数
1-ed pod number
二粒荚个数
2-ed pod number
三粒荚个数
3-ed pod number
四粒荚个数
4-ed pod number
五粒荚个数
5-ed pod number
DN50 6±0.33 12±0.25
23±0.19 25±0.08 0 SN14 9±0.23 15±0.24
20±0.26 25±0.16 0 HH43 11±0.33 15±0.19 28±0.32 29±0.45 1±0.94 SN88 5±0.14 14±0.27
23±0.35 26±0.12 0 HX3 16±0.12 60±0.44
35±0.28 0 0 HX5 22±0.34 54±0.41
34±0.42 0 0 BR21 24±0.12 43±0.25 59±0.34 0 0 W82 18±0.32 39±0.32
61±0.83 2±0.88 0 ± 代表标准差。±: standard deviation.
图3Ln分子标记的电泳图
Fig. 3 Electrophoresis of molecular makers of Ln
A: Ln分子标记检测结果。M: DL2000 marker; 1: Ln的酶切产物; 2: ln的酶切产物; 3: Ln杂合的酶切产物。B: 不同品种Ln的基因型检测。1~4: HX3、HX5、BR21和W82; 5~8: DN50、SN14、HH43和SN88; 9: W82与HH43的杂交果检测; 10: HX3与HH43的杂交果检测。
A: the detection results of Ln. M: DL2000 maker; 1: the digested product of Ln; 2: the digested product of ln; 3: the digested product of Ln heterozygous. B: The genotype of Ln in different cultivars. 1–4: HX3, HX5, BR21, and W82; 5–8: DN50, SN14, HH43, and SN88; 9: the genotype of hybrid between W82 and HH43; 10: the genotype of hybrid between HX3 and HH43.
2.5Ln突变体的表型观察
分别将ln代换到W82和HX3中, 获得2种背景下的ln突变体: W82-ln和HX3-ln。对W82-ln和HX3-ln进行叶片形状观察后发现, W82-ln的叶片由圆叶变为尖叶(图4-A), 叶片长宽比显著大于W82的叶片长宽比(图4-B)。HX3-ln的叶片也由圆叶变为尖叶(图4-C), 叶片长宽比显著大于HX3的叶片长宽比(图4-D)。同时, 对W82-ln和HX3-ln的一粒荚至五粒荚进行观察发现, W82主要为三粒荚, 二粒荚和一粒荚, 而W82-ln中不存在一粒荚, 具有较多的四粒荚和三粒荚, 甚至出现五粒荚(图4-E)。HX3主要为三粒荚和二粒荚, 而HX3-ln变为具有较多的四粒荚和三粒荚(图4-E)。同时, 对W82-ln和HX3-ln 的四粒荚数、总荚数和单株产量进行调查, 结果表明, 与W82相比, W82-ln的总荚数并没有显著变化(图4-F), 但四粒荚数显著增fdgd
加(图4-G), 最终导致单株产量显著增加(图4-H)。对HX3和HX3-ln的表型观察发现, 与HX3相比, HX3-ln的总荚数并没有产生显著变化(图4-I), 但四粒荚数显著增多(图4-J), 最终获得较高的单株产量(图4-K)。说明, 将ln代换到中高纬度和低纬度地区的大豆品种中, 能够显著提高中高纬度和低纬度大豆品种的每荚粒数。
英文手写字体3讨论
每荚粒数是大豆重要的产量相关性状, 而每荚粒数与叶片形状是由一对等位基因Ln/ln控制的[15-18]。Jeong等[16]研究表明, 将尖叶的Sowon与圆叶的V94-5152大豆品种进行杂交后, 通过精细定位, 检测到Ln基因是由定位在20号染色体上的JAGGED 编码的, 并通过近等基因系等试验发现, NIL-ln具有较多三粒荚和四粒荚。尽管该基因在10年前就被报道和克隆出来, 然而目前很少将其应用到低纬度大豆品种的改良中。此外, 传统的育种方法, 具有耗时长、费人力等缺点, 而分子设计育种能够缩减育种进程, 省事省力且能准确的改良某一特殊性状。为将理论研究与实践育种相结合, 本研究对Ln基因进行分子标记设计, 并在连续回交的过程中, 利用已设计好的分子标记, 定点检测Ln的基因型, 大大的缩短了选育品种的进程, 该项研究为分子设计育种的具体实施, 提供了重要的指导意义。在今后的分子育种研究中, 可以继续引入其他优良性状的关键基因, 并设计分子标记后, 对基因型进行定点筛选。
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