作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 365−375www.chinacrops/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00365
外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位
王晓波1蒋凌雪1,2魏利1刘林1陆伟3李文欣1王俊1 陶波2常汝镇1邱丽娟1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物种质资源引用与生物技术重点开放实验室, 北京100081; 2 东北农业大学, 黑龙江哈尔滨, 150030; 3中国农业科学院生物技术研究所, 北京100081
摘要: 通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对转基因大豆中外源EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测，
结果表明, EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中, 而且EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移法获得了转基因
大豆插入位点的侧翼序列, 序列比对表明35S上游的大豆DNA序列起始于Gm02:7912740, NOS下游的大豆DNA序
列起始于Gm02:7777705。在本研究检测序列范围内发现插入位点两侧不同位置有3个不同的未知片段、2个大豆基
因组序列倒位，同时发现2个大豆基因组片段丢失。外源基因不是以点插入方式整合, 而是导致大豆基因组约135 kb
片段的移位；NOS下游大豆基因组序列发生重排，导致一个编码HEC1和HEAT repeat两个功能域的基因(Glyma02g09790)结构受到影响, 首次发现该基因在ABA和PEG处理时下调表达，推测该基因通过ABA信号通路
参与胁迫应答。本研究通过对抗除草剂EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析, 明确了外源EPSPs基因在大豆
基因组中的整合、定位及其侧翼序列, 为转基因大豆安全评价提供了依据。
关键词: 转基因大豆; 插入位点; 基因组; EPSPs; 抗草甘膦; 定位; 侧翼序列
Integration and Inrtion Site of EPSPs Gene on the Soybean Genome in Ge-netically Modified Glyphosate-Resistant Soybean
WANG Xiao-Bo1, JIANG Ling-Xue1,2, WEI Li1, LIU Lin1, LU Wei3, LI Wen-Xin1, WANG Jun1, TAO Bo2, CHANG Ru-Zhen1, and QIU Li-Juan1,*
1 The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Germplasm Utilization / Institute of Crop Sci-ences, Chine Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2 Northeast Agricultural University, Haribin 150030, China;
3 Biotechno- logy Rearch Institute, Chine Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: The detection of genetically modified crops (GMCs) is becoming both food labels and legal necessity. The aim of this study was to identify integration and inrtion locus of foreign EPSPs gene in genetically modified soybean for the safety asss-ment of genetically modified crop. The EPSPs gene fragment was detected using gene specific primes and immunochroma-tographic strip was ud to detect the EPSPs protein. The result showed that the EPSPs gene was integrated into soybean genome and EPSPs protein could be expresd normally. Genome walking was ud to analyze the flanking quences of both 35S pro-moter and NOS terminator, and soybean genome d
ataba (Phytozome) was ud to analyze the inrtion site and study the effect
of the inrtion on soybean genome. The Dra I and Eco R V restriction enzyme were found that they could be ud to digest the soybean genome completely, and the library with adaptor was established and nest PCR was ud to amplify the flanking -quences of 35S and NOS genes in genetically modified soybean genome. The result showed that the start site of flanking region of either 35S promoter or NOS terminator was Gm02:7912740 or Gm02:7777705, respectively, which means the foreign EPSPs gene is not just inrt into one position in soybean genome, resulting translocation of one 135 kb DNA fragment. Three different unknown quences and two opposite directional soybean DNA fragments were found at the flanking region of foreign EPSPs gene castte. We also found that there were high AT content (about 70%) and low gene density in 90 kb flanking regions of the inrtion locus, and one gene coding HEC1 and HEAT repeat domain (Glyma02g09790) was found to be rearranged. RT-PCR and qRT-PCR showed that the gene was down-regulated during PEG and ABA treatment. In this study, we found the flanking -
本研究由中国农业科学院作物科学研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放课题资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 邱丽娟, E-mail: qiu_lijuan@263
第一作者联系方式: E-mail:
Received(收稿日期): 2010-01-25; Accepted(接受日期): 2010-01-31.
366作物学报第36卷
quence surrounding EPSPs gene in genetically modified soybean (GMS) was rearranged becau of the inrtion of foreign EPSPs genes and one gene coding both HEC1 and HEAT repeat domain (Glyma02g09790) which may respon to drought stress through ABA signal pathway was identified for the first time.
Keywords: Genetically modified soybean; Inrtion locus; Genome; EPSPs; Glyphosate-Resistance; Location; Flanking quence
据来自国际农业生技产业应用服务中心(ISAAA)的消息, 2008年全球转基因作物的种植面积增加了9.4%, 已达1.25亿公顷, 相当于以往13年增长的总和。大豆仍是主要的转基因作物, 2008年种植面积达6 580万公顷, 占全球转基因作物种植面积的53%[1]。抗除草剂大豆自投入商业化种植以来, 由于杂草治理便利化和高效率带来潜在利润的增加使得它的种植面积持续扩大, 处于4个主要商业化种植的转基因作物(大豆、玉米、棉花和油菜)之首。然而, 在转基因作物带来巨大效益的同时, 关于转基因食品的
安全性及对生态环境的影响等问题一直是关注的焦点。欧盟和美国、日本等国家先后出台了相应的法律和管理方法, 对转基因食品实行强制标识或自愿标识。挪威是第一个要求对转基因产品进行含量标识的国家, 该国对转基因成分的限量标识最低限为2%; 欧盟和瑞士规定食品中基因修饰成分超过1%则必须进行标识; 日本的限量标识为5%。我国于2001年5月23日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》, 2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定, 国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。日前, 欧盟已通过转基因作物试种知情权法案。转基因食品的检测主要从两个方面入手, 一是核酸水平, 即检测遗传物质中是否含有插人的外源基因; 二是蛋白质水平, 即通过插人外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测。关于插入外源基因对受体基因表达的影响鲜见报道。
国内外已有多种检测转基因作物中外源基因的方法, 如竞争PCR (competitive PCR)[2-5]、实时定量PCR (Real-Time PCR)[6-7]、PCR-ELISA方法[8-9]、环介导等温扩增检测技术等[10]。但上述这些方法均不能明确插入外源DNA序列在植物基因组中的位置, 而这些信息在欧洲和美洲转基因食品安全评价中是必需提供的资料[11-13]。我国在这方面的研究至今尚未见报道, 因此, 开展转基因品种的外源基因插入位点以及外源基因与受体基因组的整合研究, 对于我国转基因安全评价具有重要意义。
染色体步移(Genome Walking)技术主要应用于克隆启动子、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补等方面[14], 在基因定位方面也发挥了重要作用[15-16]。在前期的研究中, 我们通过构建遗传分离群体的方法已经初步明确抗草甘膦转基因大豆新品系L08-001的草甘膦抗性受单基
因控制, 定位结果表明外源基因位于大豆的D1b 连锁群, 标记BE475343、sat_373和sat_211与目标基因EPSPs紧密连锁, 最小遗传距离为3.4 cM (待发表), 但外源基因在转基因大豆新品系L08-001染色体上具体的插入位点尚不明确。本研究利用染色体步移方法获得转基因大豆35S启动子和NOS终止子的侧翼序列, 根据大豆基因组网站(Phytozome)提供的信息对获得的序列进行分析, 明确外源基因在大豆染色体上的插入位点以及外源基因的插入对大豆基因组的影响, 并对转基因插入事件进行分析, 旨在为我国转基因大豆的安全评价提供信息。
1材料与方法西班牙语在线
1.1供试材料
材料主要包括L08-001、D01、M112和M113, 其中L08-001是由转基因大豆D01与非转基因大豆M112和M113经杂交和回交育成的抗草甘膦大豆新品系。
1.2外源目的基因的PCR检测
利用EPSPs基因特异引物EPSPs-F: 5′-GCAAA TCCTCTGGCCTTTCC-3′和EPSPs-R: 5′-CTTGCCC GTATTGATGACGTC-3′对上述材料中的EPSPs基因进行检测[17], 明确外源基因是否已整合到大豆基因组中。PCR反应采用降落PCR(TD-PCR), 95℃变性30 s, 起始退火温度为62, 35
℃个循环, 每循环降低0.3, 72
℃℃延伸30 s, 其他步骤与正常PCR相同。
1.3 EPSP蛋白的检测
利用免疫层析试纸法对样品的EPSPs蛋白进行检测。将样品磨碎并加入蛋白提取液提取, 溶解获取蛋白。检测时, 先将样品垫浸在已提取好的蛋白样品溶液中, 样品溶液在毛细吸收作用下由样品垫沿NC膜向吸收垫流动。样品溶液中的特定蛋白在流经结合垫时首先与其中胶体金标记的抗体发生抗原-抗体的特异性的结合作用, 流经检测带时抗原-抗体复合物被固定在检测带上的捕获抗体结合, 聚
第3期王晓波等: 外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位367
集形成肉眼可见的金标条带, 显示检测结果为阳性。过量的金标抗体继续流动被固定在控制带上的第二抗体结合聚集形成条带, 显示检测的结果有效。
1.4 外源基因在大豆基因组中插入位点分析
取5 μg的基因组DNA分别用100 U的限制性内切酶Pst I、Dra I、Pvu I和Eco R V 酶切, 总体积500 μL于1.5 mL管中37℃过夜, 直至基因组充分酶解; 将酶切消化的DNA片段用酚∶氯仿(11)
∶抽提2次, 70%酒精洗1次, 沉淀后溶解在20 μL的重蒸水中, 电泳检测酶切效果, 选择酶切产物弥散且均匀分布的Dra I产物构建文库用于染色体步移分析。
根据酶切位点的核苷酸序列合成寡核苷酸制作接头。将50 μmol L−1长接头引物[18](Long adapter: 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGT CGACGGCCCGGGCTGGT-3′)和短接头寡核苷酸引物(Short adapter: 5′-PO4-ACCAGCCCGGGCC-NH2- 3′, 5′端磷酸化和3′端氨基化, 以提高连接效率, 降低非特异性扩增)加到一个0.5 mL管中, 在95℃温育5 min, 转移到70℃在2 h内冷却到室温并于4℃放置过夜。将4 μL酶解DNA片段产物加入200 μL 管中, 然后加1.9 μL相对应的接头和1.6 μL 10×连接缓冲液, 接着加0.5 μL T4连接酶, 16℃连接过夜。最后, 连接产物放置在70℃中 5 min以终止反应, 并加入72 μL的重蒸水稀释以形成带接头的核基因组酶解DNA片段文库。
第一轮PCR所用的引物是接头引物AP1 (引物序列: 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和基因特异性引物GSP1 (35S GSP1: 5′-TGCGAAGGATA GTGGGATTGTGCGTCA-3′; NOS GSP1: 5′-GAATC CTGTTGCCGGTCTTGCGATGATT-3′), 1 μL上述文库作为模板, 经94 40 s, 60 30 s, 72 3 min,
℃℃℃进行30个PCR循环。第二轮扩增的引物是接头引物AP2 (5′-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3′)和基因特异引物GSP2 (35S GSP2: 5′-TGATGGCATTTGT AGGAGCCACCTTCCT-3′; NOS GSP2: 5′-TAGCGC GCAAACTAGGATAAATTATCGC-3′), 用1 μL 100倍稀释的第一轮PCR产物作为模板, 退火温度提高到65,
℃其他步骤与第一轮相同。
1.5 外源基因的插入对大豆基因组的影响分析
为了进一步验证和分析转基因大豆外源基因插入事件, 首先将染色体步移获得的插入位点外侧的大豆DNA序列在大豆Phytozome数据库中进行比对分析, 明确外源基因插入位点两侧相邻大豆DNA序列在基因组中的具体位置, 并根据获得的序列设计3对引物(表1)，分别对外源基因序列插入位点两侧(35S上游和NOS下游)相邻位置及受影响NOS下游的大豆基因组序列进行特异PCR分析, 验证染色体步移获得的序列结果。
特异PCR的反应程序采用降落PCR(TD-PCR): 95℃变性30 s, 退火温度为62, 35
℃个循环, 每循环降0.3, 72
℃℃延伸40 s, 循环后72℃延伸8 min。
表1验证外源EPSPs基因插入位点及侧翼序列的特异PCR引物
Table 1 Special PCR Primers for confirmation of inrtion and flanking region quence around foreign EPSPs gene
mid autumn festival
引物名称Name of primer
上游引物序列
Forward primer quence (5′−3′)
下游引物序列
Rever primer quence (5′−3′)
六级作文模板万能句型
检测位置
Detection position
目的片段大小
demon什么意思PCR fragment
size (bp)
Inrt2 TTTATCAAGCGGCAAGTCAA
GTGCAAATTATTCAAACCCT35S上游
Upstream inrtion site of 35S
230 Inrt1 TTCGTATTGTAATCTCCCTCA
TCGCCTCAAACAGTTCTTCT NOS下游
Downstream inrtion site of NOS
275 NOS-BD GTCATCAATACGGGCAAGGC TTCACTGGCATACGAACAAT NOS下游重排序列
Rearrangment of downstream flanking
外贸英语常见专业术语quence to NOS
1154
1.6 Glyma02g09790基因的检测及其表达分析1.6.1 Glyma02g09790基因在转基因和非转基因大豆中的检测利用Glyma02g09790基因序列分别设计了的特异PCR引物(表2)对转基因和非转基因大豆进行检测(引物Glyma02g09790.1用于扩增基因第1~2外显子; 引物Glyma02g09790.2用于扩增基因第11~1
3外显子), PCR反应程序均采用降落PCR (TD-PCR), 95℃变性30 s, 起始退火温度为62, 32
权力的游戏第八季什么时候出
℃个循环, 每循环降低0.3, 72
℃℃延伸40 s, 循环后72℃延伸10 min。
1.6.2 Glyma02g09790基因的半定量RT-PCR
为研究Glyma02g09790基因的表达特性, 分别提取非转基因大豆全苗、根、茎、叶、花、经胞囊线虫处理6 d的根、100 μmol L−1 ABA处理6 h、200 mmol L−1 NaCl处理6 h和20% PEG6000处理6 h的大豆植株RNA (TaKaRa公司的RNA提取试剂盒),
368作物学报第36卷
表2 Glyma02g09790基因特异PCR引物
Table 2Specific primer for Glyma02g09790 gene
引物名称Primer name
上游引物序列
Forward primer quence (5′−3′)
下游引物序列
Rever primer quence (5′−3′)
检测类型
Detecting type
目的片段大小
PCR fragment size (bp)
DNA 787
Glyma02g09790.1 ATGGACGTGGAGAGATCTTCGCTGT ATATCTTCTTGAGCCAAACG
cDNA 293
DNA 317 Glyma02g09790.2 CGACCTGATGAACAACAAAG GAGCAACAAGCAGTCTACGC
cDNA 151
利用Promega公司生产的反转录试剂盒合成cDNA (详细反应步骤可参见公司网站www.takara. com/和/), 利用基因
特异引物进行PCR扩增, 大豆核糖体18S rRNA基
全日制英语因为RT-PCR反应的内标, 内标引物为F: 5′-CCTT GCTTGTTGCTTTACTAAATAG-3′, R: 5′-ATGCAC CTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3′, 反应程序为: 95℃
变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 28个循环,
最后一轮72℃延伸8 min。
1.6.3Glyma02g09790基因的定量表达分析(qRT-PCR)
对该基因在半定量RT-PCR中差异表达的两
个处理(20% PEG6000和100 μmol L−1 ABA)进行实
时荧光定量表达分析(qRT-PCR), 实验采用SYBR Green I荧光染料法, PCR反应体积为20 μL, 其中包
括1×SYBR Green I Real-Time PCR Master Mix (购
于TaKaRa公司), 引物0.4 μmol L−1, 在ABI公司的7300定量PCR仪上进行, 反应程序为: 95, 1 min;
℃
95, 15 s, 60, 1 min,
℃℃延伸72, 31 s, 40
℃个循环,
并在循环的延伸阶段实时采集荧光, 每个反应重复
低值易耗品科目
3次。数据处理利用2−∆∆Ct法计算基因的相对表达量。
2结果与分析
2.1 EPSPs基因插入大豆基因组
利用EPSPs特异引物对外源基因进行检测, 在
fact fiction
转基因大豆新品系L08-001及其供体亲本D01中均
检测到目标片段, 而阴性对照(水)和非转基因材料(M112和M113)中均没有扩增出目标基因(图1), 说
明外源基因已经整合到大豆基因组中。
通过双抗夹心法方法(即单抗-抗原-单抗), 并以
胶体金聚集显色这一物理显色过程检测抗原活性(图2), 在转基因大豆L08-001和D01中均检测到目
标基因EPSPs编码蛋白(图中箭头), 而在非转基因
大豆品种M112和M113中均没有检测到目标基因EPSPs编码蛋白, 表明外源基因在转基因材料中已
经正常表达。
图1转基因和非转基因大豆材料中EPSPs基因的检测结果Fig. 1 PCR products of EPSPs gene from GMO and non-GMO M: 100 bp DNA ladder; 1: 阴性对照(水); 2: D01; 3: M112;
4: M113; 5: L08-001。
M: 100 bp DNA ladder; 1: negative control (water); 2: D01;
3: M112; 4: M113; 5: L08-001.
图2转基因和非转基因大豆EPSPs蛋白的检测(箭头表示
EPSPs蛋白)
Fig. 2 Detection of EPSPs protein from GMS and non-GMS
(arrows show the protein of EPSPs)
2.2外源基因的插入对大豆基因组的影响
2.2.1 转基因大豆35S和NOS侧翼序列的获得
利用4种内切酶对D01和L08-001基因组进行
酶切, 电泳检测结果表明Dra I和Eco R V可以将基
因组完全消化(图3)。选择Dra I完全消化的大豆基
因组与接头进行连接, 构建带有接头的大豆基因组
文库, 用于巢式PCR反应。
利用35S启动子和NOS终止子特异PCR引物(GSP1)和接头引物AP1组合对上述文库进行扩增
第3期
王晓波等: 外源抗草甘膦EPSPs 基因在大豆基因组中的整合与定位 369
(图4), 由图4可以看出, 35S 与AP1的主要扩增产物长度小于NOS 和AP2的扩增产物的长度, 且二者的扩增产物均呈弥散状, 需要进行第二轮巢式PCR 扩增。
图3 大豆基因组用Pvu I 、Dra I 、Pst I 和Eco R V 酶切消化的检测结果
Fig. 3 Digestion of soybean genome using four restriction
enzymes of Pvu I , Dra I, Pst I, and Eco R V
M: 100 bp DNA ladder; 2和4表示被内切酶Dra I 和Eco R V 完全消化的转基因大豆D01和L08-001大豆基因组。 M: 100 bp DNA ladder; 2 and 4 show the completely digested re-striction enzyme D01 and L08-001 genome by Dra I and Eco R V
respectively.
图4 染色体步移的第一轮PCR 扩增 Fig. 4 First round PCR for genome walkingdownton abbey
M: 100 bp DNA ladder; 1: D01 35S; 2: L08-001 35S; 3: D01 NOS;
4: L08-001 NOS.
利用35S 和NOS 基因的巢式引物(GSP2)和接头引物AP2组合以第一轮PCR 扩增结果为模板进行PCR 扩增(图5), 可以发现35S-GSP2与AP2扩增出长度约为300 bp 的片段, 而NOS-GSP2与AP2扩增的产物长度约为 1.3 kb, 将目标片段切胶回收并测序。
2.2.2 外源基因的插入导致大豆基因组DNA 发生片段重排 将获得的序列在大豆基因组数据库中
(Phytozome)进行比对, 并对序列结构进行分析。结果表明, 35S 上游扩增出的片段中的序列来源于Gm02: 7912958~7912740, 与NOS 下游获得的序列间隔达135 kb (图6)。NOS 下游获得序列包括68 bp NOS 终止子序列、254 bp EPSPs 基因片段、3段大豆DNA 序列(分别来源于Gm02: 7777705~7777344、Gm02: 7752726~7753007和Gm02: 7752684~7752543), 此外还发现2段来源未知的序列, 其中“unknown2”长168 bp, “unknown3”长41 bp 。序列分析表明, NOS 下游3段来源于大豆基因组的序列中, 第2段序列与其他2段序列位于不同的DNA 编码链(方向不同), 与第1段序列的物理距离为24 kb, 表明在插入位点附近大豆基因组发生了DNA 重排。
图5 染色体步移的第二轮PCR 扩增 Fig. 5 Second round PCR for genome walker
M: 100 bp DNA ladder; 1: D01 35S; 2: L08-001 35S; 3: D01 NOS;
4: L08-001 NOS.
为进一步检测插入位点, 用插入位点两侧设计的两对引物(Inrt1和Inrt2, 图7-A)扩增, 在非转
基因大豆品种M112和M113中扩增出了目标片段, 在转基因材料中没有扩增出目标片段, 说明转基因大豆中该位点受到了影响。为验证侧翼序列的准确性, 根据染色体步移获得的DNA 序列设计引物(NOS-BDF 和NOS-BDR, 图7-B)对转基因和非转基因材料进行扩增, 结果只在转基因材料中扩增出了目标片段, 且片段长度与预期吻合, 说明染色体步移获得的序列是可靠的(图7-B)。
2.2.3 外源基因插入位点附近基因组DNA 碱基含量 对外源基因插入位点的侧翼序列AT 含量进行分析, 结果表明, 35S 上游序列中AT 含量为75.34%, NOS 下游序列中AT 总含量为71.57%, 可见EPSPs 插入位点两侧序列所在的90 kb 范围内AT 碱
