2021 年 2 月第 42 卷第 3 期
生物工程
食品研究与开发
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DOI : 10.12161/j.issn.1005-6521.2021.03.026
高转化大豆异黄酮乳酸菌的筛选及
在豆乳中的发酵特性
黄玉军，周帆，于俊娟，李颖华，顾瑞霞*
基金项目：2019年国家重点研发计划重点专项(2019YFF0217602)
作者简介：黄玉军(1972—)，男(汉)，副教授，博士，研究方向：乳酸菌功能和安全性分析。
*通信作者：顾瑞霞(1963—)，男(汉)，教授，博士，研究方向：乳品科学。
(扬州大学江苏乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127)
摘 要：为提高大豆异黄酮生物活性及利用度，该研究以含七叶苷和柠檬酸铁的特殊培养基，从实验室保藏的人源乳 酸菌中筛出产茁-葡萄糖苷酶目标菌株，并采用高效液相色谱法测定其发酵豆乳转化大豆异黄酮的能力，分析持水
力、产酸速率和发酵末活菌数。结果显示，从140株乳酸菌中筛出的12株目标菌株，菌株58和菌株m91发酵豆乳产
大豆异黄酮苷元能力最强，总量分别达59.64.58.06 mg/L ，均在原豆乳的8倍以上，显著高于其余乳酸菌(P <0.05)o 在 发酵豆乳基本特性研究中表明，菌株58发酵豆乳持水力为35.10%，发酵末活菌数为8.78 lg(CFU/mL )，到达发酵终点
prentice hall
用时11.50h ，并且产酸速率快。经16SrDNA 测序及系统发育分析，优选菌株58为植物乳杆菌。
关键词：乳酸菌出-葡萄糖苷酶；豆乳；大豆异黄酮；发酵特性
Screening of Lactic Acid Bacteria with High Conversion of Soybean Isoflavones and
Fermentation Characteristics in Soybean Milk
HUANG Yu-jun,ZHOU Fan , YU Jun-juan , LI Ying-hua , GU Rui-xia *
(Key Lab of Dairy Biological Technology and Safety Control , Yangzhou University , Yangzhou 225127,
Jiangsu ， China )
Abstract : In order to improve the biological activity and utilization of soybean isoflavone ，the target strain
producing 茁-glucosida was screened from human lactic acid bacteria prerved in the laboratory in a special medium containing aescin and iron citrate. The transformation ability of soybean isoflavone was determined by high performance liquid chromatography and the water holding capacity ，acid production rate and the number of viable bacteria in the end of fermentation were analyzed. The results showed that among the 12 target strains
screened out from 140 strains of lactic acid bacteria ， strain 58 and strain m91 had the strongest ability to produce soybean isoflavone aglycones with the total amount of 59.64 mg/L and 58.06 mg/L ，respectively ， which were more than 8 times of that of the original soybean milk ，significantly higher than that of other lactic
acid bacteria (P<0.05). The r esults showed that the water holding capacity of strain 58 was 35.10%，the
number of viable bacteria was &78 lg (CFU/mL ), it took 11.50 h to reach the end of fermentation ，and the acid
[20] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版四部[M].北京： 中国医药科技出版社,2020.
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加工编辑：王艳
收稿日期：2020-10-15
2021年2月第42卷第3期食品研究与开发生物工程
—158
production rate was fast.By16S rDNA quencing and phylogenetic analysis,the optimal strain58was Lactobacillus plantarum.
Key words:lactic acid bacteria；茁一glucosida;soybean milk;soybean isoflavone;fermentation characteristics
引文格式：
黄玉军，周帆，于俊娟，等.高转化大豆异黄酮乳酸菌的筛选及在豆乳中的发酵特性[J].食品研究与开发,2021,42(3)：157-162.
HUANG Yujun,ZHOU Fan,YU Junjuan,et al.Screening of Lactic Acid Bacteria with High Conversion of Soybean Isoflavones and Fermentation Characteristics in Soybean Milk[J].Food Rearch and Development,2021,42(3):157-162.
大豆异黄酮是大豆在生长过程中形成的一种次级代谢产物，又称植物雌激素，可以抗抑郁w、预防心血管疾病比预防骨质疏松症［3-4］、预防并改善乳腺癌、前列腺癌冋、缓解更年期综合症、神经保护作用冋等。已发现的大豆异黄酮有12种，其中3种为游离型苷元结构（2%~3%），能被小肠上皮直接吸收，生物活性较高，是人体可以利用的有效形式，如大豆苷元、染料木素、黄豆苷等，剩余为结合型糖苷结构（97%~98%），不能被人体小肠有效吸收，生物利用度极低（＜5%），如大豆苷、染料木苷、黄豆苷元等叫大豆异黄酮的形态结构是决定其生理活性和生物利用率的关键因素，因此，当前研究热点主要集中于将结合型糖苷转化为游离型苷元。
水解大豆异黄酮的酶有茁-葡萄糖苷酶、琢-半乳糖苷酶、葡萄糖酸酶、生物乳糖酶等，前人研究较多的是茁-葡萄糖苷酶，可将外源糖苷转化为相应的苷元和葡萄糖冋。酶水解大豆异黄酮反应条件温和，具有很强的专一性，但成本较高［9］。微生物繁殖周期不长，可以实现工业化，降低高额酶成本㈣。自然界中已发现的产茁-葡萄糖苷酶的真菌有黑曲霉、红酵母、米曲霉等，其中产茁-葡萄糖苷酶效率最高的是黑曲霉。然而，大部分霉菌如黑曲霉并不是食品安全级菌株，如果要将产茁-葡萄糖苷酶菌株应用于食品中，乳酸菌更为合适。食品级的乳酸菌发酵能力和微生物转化是功能性代谢产物富集
的关键。乳酸菌中茁-葡萄糖苷酶活性较高的有干酪乳杆菌、加式乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌等［11］o
传统乳产品销售正在逐年下降，而植物基饮料正在冲击市场□，营养与口感兼备的豆乳或将成为素食主义和乳糖不耐受人群的首选代乳产品。豆乳经发酵后既能发挥大豆的营养及功能特性，又能利用乳酸菌的益生作用产生许多大豆中原本没有的营养物质，乳酸菌含有的茁-葡萄糖苷酶还可以水解大豆异黄酮的糖苷结构向生物活性更高的游离型结构转化，大大提高了大豆异黄酮的生物利用率。
本研究旨在筛出高转化大豆异黄酮的乳酸菌，并研究其在豆乳中的发酵特性，实现大豆异黄酮糖苷向苷元的转化，以增加发酵豆乳中大豆异黄酮苷元含量，提高生物活性和利用度，为研制富含功能活性物质的发酵豆乳提供新思路。
1材料与方法
1.1材料试剂
140株乳酸菌：江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室保存；大豆、白砂糖：扬州市邗江区永辉超市；七叶苷、二甲亚砜：生工生物工程（上海）股份有限公司；染料木素、大豆苷元标准品：上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸铁、甲醇、磷酸（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2仪器设备
恒温培养箱（DNP-9272型）：上海精宏实验设备有限公司；高压均质机（APV1000型）：美国SPX集团；离心机（H1650-W型）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超纯水系统（milli-Q direct8型）：法国Millipore 公司；高效液相色谱仪（1260Infinity型）：美国Agilent Technologies公司；酸度计（PHS-3E型）：上海雷磁仪器厂；凝胶图像分析系统（3026型）：法国VILBER公司；聚合酶链式反应（polymera chain reaction,PCR）仪（Nexus+x2eco型）：德国艾本德公司。
1.3试验方法
1.3.1乳酸菌的活化
将甘油保存的供试菌株接种至MRS液体培养基中,7益培养18h，活化传代2次，以保证使用前菌株的活力充分恢复。
1.3.2产酶菌株筛选
配制七叶苷和柠檬酸铁的特殊琼脂培养基，在
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MRS 液体培养基中添加质量分数0.3%的七叶苷和
0.05%的柠檬酸铁，再加1.8%的琼脂，灭菌后在60益
左右趁热加注250滋L 到96孔板的每个孔里。等平板
凝固后取培养24 h 的乳酸菌液10滋L 按编号次序加 到96孔板中。倒置48 h 培养后孔洞变成黑色的则为
产茁-葡萄糖苷酶菌株问。
1.3.3豆乳发酵工艺
除杂寅清洗寅浸泡［干豆：水=1：3 （g/mL ）,4 T , 14h ］ 寅热烫（0.5% NaHCO 3溶液,6 min ）寅磨浆［湿豆：水=
1：7 （g/mL ）］寅过滤（120目）寅煮沸寅均质（20 MPa ）寅
灭菌（105 益，15 min ）寅冷却寅接种（1.0X107 CFU/mL ） 寅发酵（37益发酵至pH 4.50）寅冷藏（4益,24h ）
1.3.4豆乳发酵特性1.3.4.1基本理化指标layer
豆乳 pH 值: 使用 pH 计测定; 豆乳酸度：参照 GB
5009239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》14］;
豆乳乳酸菌总数：参照GB 4789.35—2016（食品安全国
家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》何；
八年级英语单词表1.3.4.2持水力测定
空白离心管质量记为称取质量W 1的发酵豆乳 样品于离心管,4000r/min，离心10min ，静置10min 弃上
清后质量记为W 2，采用如下公式计算样品持水力［呵。
持水力 /%=（W 2-W ）/W 1X100
式中:W 0为离心管质量,g;W 1为离心前样品和离 心管总质量,g ； W 2为离心后样品和离心管总质量,。
1.3.4.3大豆异黄酮测定
1） 样品处理
取发酵豆乳5mL 于50 mL 容量瓶中，加入80%
甲醇溶液至接近刻度。超声波萃取20min，用80%甲
醇定容，摇匀取样品溶液置于离心管中,8 000 r/min 离 心15 min 。取上清过0.45 滋m 滤膜，收集滤液进高效液
相色谱（high performance liquid chromatography , HPLC /
系统测定呵。
2） 色谱条件
色谱柱:C 18色谱柱（250 mmx4.6 mm,5滋m ）；流动
相：乙腈；磷酸水溶液（pH3.0）；流速：1.0 mL/min ；紫外 检测波长:260nm；进样量：10滋L；柱温：30益。梯度洗 脱条件见表1。
1.3.5乳酸菌的鉴定
将乳酸菌接种到MRS 液体培养基中，37益培养
18h ，试剂盒提取乳酸菌的DNA 。采用细菌鉴定的通用
引物进行16SrDNA 基因片段扩增，扩增完成后，用1%
的琼脂糖凝胶电泳检测，得到目的条带后，扩增产物送 去测序鉴定。将菌株测序结果登录美国生物技术信息中
心/National Center for Biotechnology Information , NCBI ）159 —
表1梯度洗脱条件
Table 1 Conditions of gradient elution
时间/min
乙腈/%磷酸水溶液/%
012
8810
1882
23247630
307050307055
80
20login是什么意思
56128860
12
88
进行序列比对，并用MEGA-X 软件绘制系统发育树。
1.4数据分析
同一样品平行测定3次，试验结果为3次测定结果
的平均值，采用SPSS 19.0软件处理数据，运用ANOVA 进行显著性分析,<0.05为差异具有统计学意义。
2结果与分析
2.1产酶菌株筛选结果
在茁-葡萄糖苷酶作用下，七叶苷水解成葡萄糖和 七叶素，七叶素可与Fe 3+反应呈现棕黑色问。将实验室
保存的140株供试菌株接种于添加七叶苷和柠檬酸铁
的特殊固体培养基，培养48 h 后变为棕黑色的孔，即 为产酶目标菌株，根据颜色深浅初步判断酶活高低,
结果表明产酶目标菌株一共有12株，菌株编号分别为
11、39、54、58、117、128、m64、m91、m113、Y-5、A28 1-2、
90-2-2。
2.2高转化菌株复筛结果
2.2.1 发酵豆乳大豆异黄酮变化
分别将12株乳酸菌按1.0x107 CFU/mL 接种量接 入豆乳，测定原豆乳和不同菌株发酵豆乳后大豆苷 元、染料木素的含量。原豆乳、发酵豆乳高效液相色谱
图分别见图1、图2。
时间/min
1.大豆苷元;
2.染料木素。
图1原豆乳高效液相色谱图
Fig.1 The chromatogram of HPLC of soybean milk
乳酸菌发酵产大豆异黄酮苷元的能力以发酵后
豆乳中大豆苷元和染料木素的总量来表示，不同菌株
发酵豆乳大豆异黄酮苷元总量如图3所示
。
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—160
2
5 4 3 2 1 0
10 20 30 40 50
时间/min
1.大豆苷元;
2.染料木素。
图2发酵豆乳高效液相色谱图
(1/S E )
頑粗臺味異
Fig.2 The chromatogram of HPLC of fermented soybean milk
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)o
图3不同菌株发酵豆乳大豆异黄酮苷元总量
c
「d
r-t-
Fig.3 Content of isoflavone aglycone in soybean milk fermented by
different bacteria
原豆乳中大豆异黄酮苷元总量为7.15 mg/L，豆乳
经产酶目标菌株发酵后大豆异黄酮苷元总量均有显 著提高(P<0.05)。翟清燕等问将不同菌株用于发酵豆
乳，得到一株大豆异黄酮苷元产量最高的乳酸菌，约 为原豆乳的8倍。本研究中，有7株乳酸菌发酵后大
ridiculous是什么意思豆异黄酮苷元总量在55 mg/L 以上，其中产大豆异黄 酮苷元能力最强的是菌株58，显著高于除菌株m91
外的10株菌。菌株58发酵后大豆异黄酮苷元总量达
59.64 mg/L，约为原豆乳的&25倍，菌株m91次之，总
量达58.06 mg/L ，约为原豆乳的&12倍。菌株128、
m113发酵产大豆异黄酮苷元能力最弱，发酵后大豆异
黄酮苷元总量不到45.00 mg/L 。
2.2.2 发酵豆乳基本特性 2.2.2.1发酵豆乳pH 值变化
以pH 值降至4.50为发酵终点，12株乳酸菌发酵 过程中 pH 值变化见图 4。英语mp3
如图4所示，菌株128、A28 1-2、m113和58发酵
豆乳样品pH 值下降趋势明显倒达发酵终点(pH4.50)
用时较短，均小于12h ，菌株11,54和39发酵豆乳样 品到达发酵终点用时次之。菌株m64、117和m91发酵
豆乳样品pH 值下降速率缓慢，到达发酵终点均在18 h 以后。乳酸菌营养要求苛刻，自身蛋白水解能力较弱,
时间/h
图4不同菌株发酵豆乳pH 值变化
Fig.4 pH change of soybean milk fermented by different strains
因此单独发酵时间较长是一种较普遍的现象［20-21］。
2.2.2.2 发酵豆乳酸度变化
以pH 值降至4.50为发酵终点，12株乳酸菌发酵 过程中酸度变化见图 5。
Fig.5 Acidity change of soybean milk fermented by different
strains
可滴定酸度反应了包括肽段和游离氨基酸残基
在内的所有酸性基团的总和［2雾如图5所示，除菌株54 发酵豆乳样品外，另外11株乳酸菌的发酵豆乳样品酸
度均为30.00毅T 以上，所有乳酸菌发酵豆乳样品的酸
度在3 h 后上升趋势明显。菌株58到达发酵终点的酸 度最高，为35.01叮，菌株90-2-2、m91发酵豆乳样品 的酸度稍低于菌株58，分别为34.38 °T,34.01 °T O 菌株
blinds
54发酵豆乳样品的酸度最低，为29.89毅T 。豆乳中糖类
主要是水苏糖、棉子糖和蔗糖，缺少乳酸菌生长所需的 乳糖，乳酸菌不能大量生长繁殖而产生足够乳酸，因
此发酵豆乳酸度偏低［23］。
2.2.2.3 发酵豆乳活菌数
以pH 值降至4.50为发酵终点,12株乳酸菌发酵 前后豆乳活菌数变化见图 6。
发酵豆乳中乳酸菌活菌数在出厂期须达106CFU/mL
以上的，如图6所示，发酵初12株乳酸菌发酵豆乳样 品活菌数无显著性差异，而发酵末活菌数都显著提
高
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菌株编号
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)o
图6不同菌株发酵豆乳活菌数变化
Fig.6 Viable count of soybean milk fermented by different strains
(P<0.05)。其中，菌株A28 1-2发酵豆乳样品活菌数变
化值最大，发酵末活菌数最高，达&84 lg(CFU/mL )，菌
株58发酵末活菌数为&78 lg(CFU/mL )，显著高于菌
株m91，菌株m91为&55 lg(CFU/mL )o 菌株m64发酵 豆乳样品活菌数变化值最小，发酵末活菌数最低，仅
如图7所示，除菌株11、54、m64，另外9株菌的发 酵豆乳样品持水力都达30.00%以上。其中，菌株58发
酵豆乳样品的持水力显著高于除菌株A28 1-2的另外
10株菌，持水力为35.10%，菌株A28 1-2次之，持水力
为34.70%。菌株11发酵豆乳样品持水力最低，仅为
29.17%。发酵豆乳持水力是由蛋白质三维网状结构的
凝胶状态形成的，蛋白质是将流动性较好的豆乳转化 为半固态发酵豆乳的微观物质基础何。持水力低可导
致乳清析出，影响产品感官及风味残留。
2.3优选乳酸菌鉴定结果
根据菌株发酵豆乳后大豆异黄酮苷元含量高低,
并结合其发酵特性分析，故选用菌株58为高转化大豆
异黄酮优选乳酸菌。将纯度符合要求的优选乳酸菌
DNA 进行PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增
产物浓度。检测结果如图8所示，菌株在1 500 bp 左 右出现非常清晰的条带，无特异性扩增，且亮带无弥
散、拖尾现象。
M 58
8.39 lg(CFU/mL )°2.2.2.4 发酵豆乳持水力
keep bleeding以pH 值降至4.50为发酵终点,2株乳酸菌发酵
豆乳持水力见图7。
3836343230
2826
24
c
cd dc
r-=~
h gh
c
f
-*
M 为 DNA Marker;58 为菌株 58。
图8 PCR 扩增产物凝胶电泳图
Fig.8 Gel electrophoresis for PCR
菌株编号
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
图7不同菌株发酵豆乳持水力
Fig.7 Water holding capacity of soybean milk fermented by
different strains
将菌株58的16S rDNA 基因序列与GenBank 种friendswithbenefits
的序列进行比对，发现与乳杆菌属成员具有较高的序
列相似性，用Neighbor Joining 方法构建的系统发育树
如图9所示。表明菌株58与植物乳杆菌种亲缘关系
48九年级英语unit9
70.050
81 Lactobacillus plantarum strain AMT 74419( CP052869.1)
100 Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis strain DSM 16365( NZ CP032751.1) r Lactobacillus plantarum strain NRIC 1592( AB362726.1)0 58
)I • Lactobacillus koreensis strain 26—25(NZ CP012033.1)100J Lactobacillus brevis ATCC 367(NC 008497.1)
r -- Pediococcus damnosus strain TMW 2.1535(NZ CP012288.1)0
Lactobacillus rhamnosus GG /NC 013198.1)------Lactobacillus alimentartus DSM 20249( NZ CP018867.1)
63— Lactobacillus curvaius JCM1096 DSM20019(NZ CP026116.1)
Lactobacillus nenjangensis strain SH —Y15(NZ CP043939.1) Lactobacillus pentosus strain DSM 10667( NZ CP032744.1) Lactobacillus pentosus strain, Heal19(CP055123.1)
Lactobacillus pentosus strain DSM 20314(NZ CP032757.1)
100
图9菌株58和相关细菌16S rDNA 基因序列系统发育树
Fig.9 Phylogenetic tree bad on 16S rDNA quence of strain 58 and related
strains
